內質網應激誘導劑Salubrinal在大鼠急性肺損傷的作用機制的研究

張海濤,饒艷偉*,賈桂風

(1.吉林省人民醫院 重癥醫學科,吉林 長春130021； 2.吉林大學第一醫院 婦產科)

內質網應激誘導劑Salubrinal在大鼠急性肺損傷的作用機制的研究

張海濤1,饒艷偉1*,賈桂風2

(1.吉林省人民醫院 重癥醫學科,吉林 長春130021； 2.吉林大學第一醫院 婦產科)

急性肺損傷是有各種誘因(嚴重感染、膿毒癥、外傷、休克、有害氣體吸入等)導致的急性以及進行性的缺氧性呼吸衰竭。其臨床表現為起病急，常規吸氧后低氧血癥難以糾正，雙肺可聞及濕啰音等。目前臨床上主要以對癥治療、呼吸支持和液體療法為主[1]。但是也有通過糖皮質激素、前列腺素E1、環氧化酶抑制劑進行治療。Salubrinal為選擇性抑制elF2a去磷酸化的抑制劑，是在大鼠嗜鉻細胞瘤發生內質網應激而引起的凋亡中的化合物篩選出的小分子化合物，進一步研究發現其可以選擇性誘導elF2a磷酸化和抑制去磷酸化作用，最終可以保護細胞避免內質網應激相關的凋亡。Boyce M的研究認為Salubrinal引起細胞中GRP78表達增高，認為Salubrinal可能上調GRP78來避免細胞中的內質網應激相關凋亡的發生[2,3]。本研究以急性肺損傷大鼠為研究對象，通過觀察大鼠血清中谷胱甘肽的水平和肺組織中Nrf2蛋白的表達，闡明選擇性磷酸酶抑制劑Salubrinal在急性肺損傷大鼠肺損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑

脂多糖(美國 Sigma 公司)，Salubrinal (Sal，美國 Sigma 公司)，Nrf2蛋白抗體(美國 Santa Cruz 公司)，3，3'-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、谷胱甘肽試劑盒(福州邁新生物制品公司)。

1.2 實驗動物及分組

健康Wistar大鼠48只，雌雄各半，體質量(250±10)g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK-(吉)2008-0005。將大鼠隨機分為對照組、 急性肺損傷組、 急性肺損傷 Sal 1.0治療組，每組16只。

1.3 動物模型制備及處理

① 對照組：一次性灌胃1 mL生理鹽水；每日2次腹腔注射1 mL生理鹽水。② 急性肺損組(ALI)：一次性給予5 mg/kg 脂多糖靜脈注射。③ Sal 1.0治療組，一次性給予5 mg/kg 脂多糖靜脈注射造模后，腹腔注射1.0 mg/kg/天 Salubrinal。本實驗動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.4 檢測指標及方法

造模7 d后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，留取肝素化的大鼠尾靜脈血。取肺組織-80 ℃保存。同時右肺中葉應用10%中性甲醛溶液予以固定48 h，之后進行脫水、浸蠟、包埋、切片等過程，最后給予蘇木素-伊紅(HE)染色。冷凍肺組織行蛋白質免疫印跡試驗(Western Blot)。

1.4.1 肺組織形態學觀察 取肺組織切片，經脫蠟、HE染色、梯度乙醇脫水、透明、封固光鏡下觀察。

1.4.2 Western Blot檢測肺組織Nrf2蛋白表達 提取肺組織總蛋白，Bio-Rad 法測定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟操作，測定Nrf2樣品的蛋白濃度。用Image J圖像處理軟件計算各條帶灰度值，分析Nrf2蛋白的表達情況。以目的蛋白與內參照β-肌動蛋白(β-actin)的灰度值比值表示。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 肺組織形態學觀察

急性肺損傷組大鼠肺組織部分損傷，出現了大量的炎癥及局部肺組織出血明顯，鏡下觀察有塌陷的肺泡壁，肺泡腔擴大，肺泡隔顯著增厚；而Sal 治療組肺組織病理改變較急性肺損傷組明顯減輕(圖1)。

圖1 急性肺損傷大鼠肺組織HE染色(×40)

2.2 Western Blot檢測Nrf2蛋白表達

與對照組相比，急性肺損傷組Nrf2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與急性肺損傷組相比，Sal組Nrf2蛋白表明顯達增高，差異有顯著的統計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 急性肺損傷大鼠的肺組織中Nrf 2蛋白的表達

2.3 血清學檢測發現

急性肺損傷大鼠Sal 治療組的血清中GSH/GSSG值(3.71±0.06)與急性肺損傷組(1.98±0.16)相比明顯增高(P<0.05)。

3 討論

急性肺損傷是有各種誘因導致的急性以及進行性的缺氧性呼吸衰竭。其臨床表現為起病急，常規吸氧后低氧血癥難以糾正，雙肺可聞及濕羅音等。研究發現其病死率仍然較高，依照1994年頒布的ALI/ARDS的診斷標準后，不同國家和地區的統計顯示其病死率仍然為30%-40%[4]。但是在中國上海的統計住院病死率68.5%[5]，北京地區住院病死率為52.0%[6]。所以，急性肺損傷的病死率在我國總體水平仍然很高，需要進行相關的藥物創新。本實驗通過應用選擇性磷酸酶抑制劑Salubrinal對急性肺損傷大鼠進行干預觀察，為臨床治療提供一個新的方向。

Salubrinal為選擇性抑制elF2a去磷酸化的抑制劑，是在大鼠嗜鉻細胞瘤發生內質網應激而引起的凋亡中的化合物篩選出的小分子化合物，進一步研究發現其可以選擇性誘導elF2a磷酸化和抑制去磷酸化作用，最終可以保護細胞避免內質網應激相關的凋亡。Boyce M.的研究認為Salubrinal引起細胞中GRP78表達增高，認為Salubrinal可能上調GRP78來避免細胞中的內質網應激相關凋亡的發生[2,3]。本研究中，我們發現通過給予Salubrinal處理急性肺損傷大鼠后，發現大鼠肺組織形態有明顯的改變。其中在孫明莉等[7]在百草枯中毒大鼠經過Salubrinal處理后，發現Salubrinal也能明顯改變其肺組織的形態。同時我們也檢測了血清中的還原型谷胱甘肽的水平，發現與急性肺損傷組相比，Sal治療組的還原型谷胱甘肽的水平明顯增高。這說明Salubrinal能提高大鼠血清中的抗氧化水平，對體內產生保護性作用。進一步的研究我們檢測了大鼠肺組織的Nrf2蛋白表達，研究發現與急性肺損傷組相比，Sal治療組的Nrf2蛋白表達明顯增高。其中研究發現在正常的細胞中 Nrf2蛋白水平表達很低，當細胞在外界刺激后處于應激的狀態時，細胞中的Nrf2調節因子 Keap1在半胱氨酸殘基直接修飾作用后，改變了對 核內Nrf2 調節作用，保持了Nrf2穩定性，之后進入細胞核內激活抗氧化酶以及解毒基因的表達。保證Nrf2 蛋白的穩定性對于應激狀態下Nrf2途徑的激活起到了主要的作用[8]。因此，在細胞處于應激的條件下，Keap1-Nrf2 途徑通過一種去抑制作用促使 Nrf2 從 Keap1 的抑制作用中解放出來發揮抗氧化應激作用，進而提高細胞的抗氧化水平。所以，在本研究中我們認為Salubrinal可能是通過活化 Keap1-Nrf2 途徑，降低急性肺損傷大鼠的ROS水平，提高了其抗氧化水平起到保護性作用，有可能為臨床的急性肺損傷的患者提供一種新的治療策略。

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吉林省衛生計生委資助(2015SZC13)

1007-4287(2017)04-0696-03

2016-06-11)

*通訊作者