氧化苦參堿對活化的小膠質細胞的抑制作用

張燕+李玲+王俊燕+王銀+李云鴻

（1.寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004；2.銀川市第一人民醫院，寧夏 銀川 750004）

摘要：目的：研究氧化苦參堿（OMT）對激活的小膠質細胞的作用及機制。方法：培養BV2小膠質細胞株，實驗分為對照組（Con），細菌脂多糖（LPS）組，OMT實驗組。應用western-blot檢測OMT對LPS激活的BV2細胞HSP60的影響，ELISA檢測OMT對HSP60和TNF-α釋放的作用。結果：LPS組中HSP60的表達及HSP60、TNF-α的釋放都比對照組顯著增加，加入OMT后，這些因子的水平都明顯降低。結論：OMT可能抑制通過HSP60信號通路降低炎癥因子的產生而發揮神經保護作用。

關鍵詞：熱休克蛋白60；氧化苦參堿；小膠質細胞

中圖分類號：G642.423 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2017）18-0279-02

氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）是中藥苦參的提取物。研究證明氧化苦參堿擁有抗炎、抗腫瘤等許多藥理學功能[1]，但OMT在中樞神經系統中的作用仍未知。熱休克蛋白60（HSP60）是一類應激蛋白，對機體具有保護作用。但研究表明，在病理狀態下，細胞內過量表達HSP60，并將其釋放到胞外，作為自身免疫因子，導致細胞凋亡[2]。我們前期研究表明枸杞多糖可通過抑制小膠質細胞HSP60的表達及釋放而起到神經保護作用[3]。本研究將探討OMT是否具有相似的神經保護作用。

一、材料與方法

（一）材料

氧化苦參堿和LPS購自Sigma公司；HSP60抗體購自ENZO公司；β-actin抗體購自Cell Signaling公司；BCA試劑盒購自Thermo公司；HSP60和TNF-α ELISA試劑盒購自欣博盛公司。

（二）方法

1.BV2細胞的培養。BV2小膠質細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中。BV2細胞中加入1μg/ml LPS 30min后，加入20μg/ml的OMT溶液處理24小時后收集細胞總蛋白及上清液。

2.利用Western blot檢測HSP60表達。藥物處理完畢，提取各組的蛋白并收集上清液，BCA法進行蛋白定量。利用10% SDS-PAGE分離蛋白后轉至PVDF膜，用脫脂牛奶在搖床上封閉膜2h。加入一抗，4℃過夜。利用TBST充分洗滌膜后，用二抗室溫孵育1h，ECL試劑顯色成像。

3.利用ELISA檢測HSP60及TNF-α的釋放。應用HSP60和TNF-α ELISA試劑盒，依據操作步驟，在酶標儀上450nm處測定各孔光密度值（OD）。

4.統計學分析。采用SPSS11.9進行統計學分析。實驗數據用x±s表示，組間比較用方差分析，進一步比較兩兩間差異采用Student-Neuman-KeulsTest方法。

二、結果

（一）OMT抑制LPS激活后的小膠質細胞中的HSP60的表達及釋放

Western blot檢測HSP60的表達情況，結果表明與CTRL組相比較，LPS顯著增加了HSP60的表達，而OMT能減少HSP60的產生（P<0.05）。ELISA檢測細胞外分泌的HSP60的實驗表明，LPS增加了HSP60的釋放，而OMT能減少細胞外HSP60的釋放。

（二）OMT抑制激活的小膠質細胞TNF-α的產生

ELISA結果表明，與對照組相比較，LPS處理后的小膠質細胞TNF-α的釋放明顯增加，在OMT處理的實驗組中，TNF-α的產生顯著下降，差別有統計學意義（P<0.05）。

三、討論

許多神經退行性疾病的發生與小膠質細胞的激活有關，阻止小膠質細胞的激活特別是阻止生成神經毒性因子，可作為治療神經退行性疾病的方法之一[4]。OMT是中藥苦參的一種主要成分，并且擁有多種藥理學優點[5]。研究顯示在大鼠的大腦局部缺血的模型中，OMT能夠減少NF-κB的產生和抑制中樞神經系統中的炎性反應從而減小大腦的損傷[6]。然而OMT的神經保護功能機制尚不明確。本文中，我們研究了OMT的神經保護功能及分子機制。HSP60在心衰病人中被發現可以轉位到細胞膜和分泌到細胞外[7]。但是HSP60在中樞神經系統中的作用研究報道還很少。

我們的實驗結果發現BV2經LPS激活后，胞內HSP60的表達明顯增高，并將其釋放至胞外，引起炎癥因子TNF-α的產生。而OMT可抑制胞內HSP60的表達，胞外的釋放及TNF-α的產生，可能是一種潛在的治療神經系統炎性疾病的藥物。

參考文獻：

[1]Yuan XP，Wang YY，Du DR，et al：The effects of the combination of sodium ferulate and oxymatrine on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice [J].Inflammation 35：1161-1168，2012.

[2]Gupta S，Knowlton A A. HSP60，Bax，apoptosis and the heart [R].J Cell Mol Med. 2005，9（1）：51.

[3]Teng P，Li YH，Cheng WJ，Zhou L，Shen Y，Wang Y. Neuroprotective effects of Lycium barbarum polysaccharides in lipopolysaccharide-induced BV2 microglia cells [J].MolecularMedicine Reports，2013，7：1977-1981.

[4]Gonzalez-Scarano F，Baltuch G. Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases[J].Annu Rev Neurosci，1999；22：219-40.

[5]Huang M，Hu YY，Dong XQ，et al：The protective role of oxymatrine on neuronal cell apoptosis in the hemorrhagic rat brain[J].J Ethnopharmacol 143：228 235，2012.

[6]Liu Y，Zhang XJ，Yang CH：Oxymatrine protectsrat brains against permanent focal ischemia and downregulates NF- kappaB expression. J Brain Res 1268：174-180，2009.

[7]Kim SC，Stice JP，Chen L，Knowlton A A. Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes，and apoptosis [J].Circ Res，2009；105：1186 1195.

收稿日期：2016-11-30

基金項目：2016年寧夏回族自治區大學生創新創業訓練計劃項目（NXCX2016122）

作者簡介：張燕（1993-），女（漢族），寧夏銀川人，寧夏醫科大學生物技術專業本科生；李玲（1973-），女（漢族），寧夏銀川人，專科，主治醫師，銀川市第一人民醫院高壓氧科，主要從事高壓氧神經科學研究；王俊燕（1992-），女，寧夏銀川人，寧夏醫科大學生物技術專業本科生；王銀（1973-），女（漢族），寧夏銀川人，教授，博士，碩士生導師，寧夏醫科大學神經生物學系主任，主要從事神經生物學研究。

通訊作者：李云鴻（1972-），男（漢族），寧夏銀川人，副教授，碩士，寧夏醫科大學，主要從事神經生物學研究。