多巴胺對大鼠胰島素分泌的影響及機制研究

鐘向琴，丁亞琴，任樂樂，白 濤，，劉萌萌，劉云峰，章 毅

(山西醫科大學 1.基礎醫學院藥理學教研室、2.第一醫院內分泌科，山西 太原 030001)

多巴胺對大鼠胰島素分泌的影響及機制研究

鐘向琴1，丁亞琴1，任樂樂1，白 濤1，2，劉萌萌1，劉云峰2，章 毅1

(山西醫科大學 1.基礎醫學院藥理學教研室、2.第一醫院內分泌科，山西 太原 030001)

目的 研究多巴胺(dopamine,DA)對大鼠胰島素分泌的影響及可能機制。方法 ♂ SD大鼠的胰腺經過膠原酶P消化、Histopaque 1077梯度離心后得到純化的胰島，Dispase Ⅱ將胰島消化為單個細胞。應用胰島素分泌實驗來驗證DA對胰島素分泌的作用，通過膜片鉗技術和鈣成像技術記錄β細胞內向性鈣電流、動作電位時程和細胞內Ca2+濃度，研究DA對大鼠胰島素分泌的作用機制。結果 在2.8 mmol·L-1的葡萄糖中，DA對胰島素的分泌沒有產生明顯的影響；在16.7 mmol·L-1的葡萄糖中，DA呈濃度依賴性抑制胰島素的分泌。DA干預后，抑制了胰島β細胞上內向性鈣電流，縮短動作電位時程，減少了細胞內Ca2+濃度。結論 DA通過抑制β細胞上內向性鈣電流，進而縮短了動作電位的時程，降低細胞內Ca2+濃度，最終抑制胰島素的分泌。

多巴胺；胰島β細胞；胰島素分泌；電壓門控性Ca2+通道；動作電位；鈣成像

多巴胺(dopamine,DA)是一種主要由大腦分泌的神經傳遞物質，負責控制人的運動、情緒與感覺，并將興奮信息上傳，與精神和神經系統方面的疾病密切相關[1]。研究表明[2]，在外周組織如腎臟、胰腺和上消化道中也可以合成并釋放多巴胺，調節非神經系統的功能。由于外周多巴胺無法穿過血腦屏障，不會影響到神經系統的功能，但是它可以在其合成的組織中發揮著旁分泌的作用。近年來，多巴胺與胰島素之間的關系受到越來越多的關注。臨床發現長期使用多巴胺的前體左旋多巴治療帕金森疾病，這些病人通過口服糖耐量實驗發現糖的耐受力明顯下降，這種現象在帕金森患病人群中高達50%～80%[3]。多巴胺被認為可以影響胰島素的分泌[4]，然而其作用機制尚不明晰。本研究擬通過胰島素分泌實驗以及膜片鉗、鈣成像技術，探究多巴胺對胰島素分泌的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠,♂,由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，體質量180～250 g。生產許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。

1.2 試劑 Dopamine hydrochloride(美國Sigma，批號：BCBG8676V)；膠原酶P(瑞士Roche，批號：11104222)；BSA(北京索萊寶，批號：83100513)；RPMI 1640培養基(上海生工，批號：C518FA0002)；胎牛血清(上海生工，批號：B326FA0092)；青、鏈霉素(北京索萊寶，批號：20150909)；HEPES(北京索萊寶，批號：710B048)；Histopaque 1077(美國Sigma，批號：RNBF1783)；Dispase II(美國Amresco，批號：10888700)； D-葡萄糖(北京索萊寶，批號：405A0918)；胰島素檢測試劑盒(北京北方生物技術研究所，批號：20160320)。

1.3 儀器 電子天平(上海精密儀器，型號：GB/T26497)；體式顯微鏡(上海中恒儀器,型號：SM262)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS, 型號：AE-2000)；臺式離心機(長沙湘儀儀器, 型號：SC-3610)；細胞培養箱(北京博奧恒信生物科技, 型號：HF100)；Narishige MODEL PP-830電極拉制儀(日本Narishige, 型號：PP-830)；MIRO FORGE MF-830拋光儀(日本Narishige, 型號：MF-200)；EPC10全自動膜片鉗(德國HEKA, 型號：MP-285)；鈣成像(北京MDE, 型號：LAMBDA 10-B)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠胰島、胰島細胞的分離與培養 ♂ SD大鼠斷頭處死后，將1 g·L-1膠原酶P溶液(RPMI 1640培養基溶解)緩慢注入到膽總管中,分離的胰腺經37℃水浴消化、Histopaque 1077梯度離心得到單個胰島，并放于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。分離胰島細胞時，使用5 g·L-1的Dispase Ⅱ酶液消化胰島，將細胞懸液均勻地接種在經細胞黏附劑處理過的玻片上，加入培養液后放于細胞培養箱中培養[5]。

1.4.2 胰島素釋放實驗 分得的單個胰島經過夜修復后備用，每組7管，每管中放入5個胰島。首先，使用2.8 mmol·L-1葡萄糖孵育液37℃孵育30 min,棄除上清；然后，分別加入2.8 mmol·L-1和16.7 mmol·L-1葡萄糖孵育液以及含有不同濃度的DA孵育30 min,收集上清液，采用放免法測得胰島素含量；最后，加入乙醇粉碎胰島，測得胰島素的總含量。

1.4.3 膜片鉗實驗 將分離的胰島細胞置于倒置顯微鏡下，細胞膜電容>7 pF的為β細胞。記錄電極經PP-830電極拉制儀兩步法拉制，充滿電極內液后電阻為4～7 MΩ,當電極尖端與細胞膜之間形成高阻封接(≥1 GΩ)后，負壓破膜，使電極內液與細胞內液相通，形成全細胞記錄模式。記錄電壓門控性鈣電流時，在-70 mV鉗制電壓下給予-50 mV～30 mV的電壓刺激，記錄50 ms內每次遞增10 mV的鈣電流。記錄動作電位采用電流鉗模式，封接破膜后，給予150 pA、4 ms的電流注入，計算從去極化開始到復極化于靜息電位之上10 mV的時程為動作電位時程[6]。

1.4.4 鈣成像實驗 細胞在37℃的環境下用2 μmol·L-1的Fura-2AM熒光探針染料染色約30 min。然后將細胞放置于激光共聚焦顯微鏡上，設定激發波長為340 nm/380 nm，發射波長為510 nm。以持續灌流的方式給予2.8 mmol·L-1葡萄糖(2.8 G)、16.7 mmol·L-1葡萄糖(16.7 G)和10 μmol·L-1DA(以16.7 G溶解)，F340/F380的比值反映灌流液體對細胞內鈣離子濃度的影響。該實驗在30℃環境中進行。

2 結果

2.1 DA對大鼠胰島素分泌的影響 在2.8 mmol·L-1葡萄糖(2.8 G)和16.7 mmol·L-1葡萄糖(16.7 G)的基礎上分別加入不同濃度的DA(0、1、10 mmol·L-1)，孵育30 min后，檢測上清液中胰島素的含量。Tab 1結果顯示，在2.8 G的條件下，DA對胰島素的分泌沒有產生明顯的影響；在16.7 G的條件下，DA呈濃度依賴性抑制胰島素的分泌(P<0.01)。

Glucoseconcen?tration/mmol·L-1Dopamine/μmol·L-101102．8G12．498±3．05614．184±2．5489．042±1．18116．7G158．588±9．721##91．154±5．528?45．930±6．706??

##P<0.01vs2.8 G(DA 0 μmol·L-1);*P<0.05,**P<0.01vs16.7 G(DA 0 μmol·L-1)

2.2 DA對胰島β細胞電壓門控性鈣通道的影響 通過電壓鉗技術，在-70 mV的鉗制電壓下給予-50 mV～30 mV的電壓刺激50 ms，每次遞增10 mV檢測胰島β細胞上鈣電流。與對照組相比，DA(10 μmol·L-1)明顯地抑制了鈣電流[0 mV時，對照組(-3.963±0.406) pA/pF,DA組(-2.344±0.429) pA/pF,P<0.01]。見Fig 1。

2.3 DA對胰島β細胞動作電位時程的影響 通過電流鉗技術，給予細胞150 pA、4 ms的電流注入，檢測給藥前后動作電位時程的變化。與對照組相比，DA(10 μmol·L-1)明顯地縮短了動作電位的時程(P<0.01)。見Tab 2。

GroupActionpotentialduration/msControl59．578±4．493TreatmentwithDA32．968±3．166??

**P<0.01vscontrol

2.4 DA對胰島β細胞內Ca2+濃度的影響 細胞在37℃的環境下使用2 μmol·L-1的Fura-2AM孵育約30 min，然后放置于340 nm/380 nm激發波長，510 nm發射波長下，測得DA對細胞內Ca2+濃度的影響。Fig 2結果顯示，DA使細胞內Ca2+濃度減少。以灌流初始值(F0)標化后結果如下：2.8 G(0.036±0.001)，8.3 G(0.631±0.033)，DA(0.482±0.034)。

Fig 1 Effect of DA on voltage-gated calcium channels

A,B：Representative current traces recorded under the different treatment as indicated;C：Summary of the mean current density of Ca2+currents at 0 mV(n=6).**P<0.01vscontrol

3 討論

在生理條件下，葡萄糖是影響胰島素釋放最主要的因素。葡萄糖通過主動轉運的方式進入細胞內部后，經過糖酵解和氧化磷酸化生成ATP，ATP使細胞膜上的ATP敏感性鉀通道(KATP)關閉，細胞膜去極化，達到一定程度后，電壓依賴性鈣通道開放，外鈣內流，細胞內鈣離子濃度升高，使成熟的分泌囊泡附著于微管微絲上，并通過兩者的相互作用促進囊泡膜與細胞膜融合，最終誘導胰島素的釋放[7-8]。除此之外，外周的多種配體也發揮著重要的調節作用，如血管活性腸肽(VIP)、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、乙酰膽堿(Ach)等。有數據顯示，多巴胺作為一個生理因子可以與β細胞上的多巴胺受體結合調節細胞的分泌活動[2,7,9]，外周多巴胺的異常會影響胰島素的正常調節。帕金森患者在治療過程中，通常使用左旋多巴和芐絲肼以提高中樞神經系統中多巴胺的濃度，并阻止外周左旋多巴轉換為多巴胺給機體帶來負面影響[10]，但在這一過程中仍然會有部分的多巴胺進入到外周[2]，抑制葡萄糖刺激胰島素的分泌活動，給胰島功能造成慢性的壓力，使得帕金森患者中糖耐量異常現象較為普遍[3,10]。因此，了解外周配體，尤其是多巴胺對于調節胰島素釋放的機制變得越來越重要。現今的文獻報道中，關于多巴胺對胰島素分泌的影響存在著爭議，有部分學者認為多巴胺及其類似物可以抑制葡萄糖刺激胰島素分泌，而少部分認為急性多巴胺的大量累積可以促進胰島素的分泌[9]。在本實驗中，我們發現DA在16.7 G的基礎上明顯地抑制了胰島素的分泌，而在2.8 G的基礎上對胰島素的分泌活動影響較小。電壓-電流曲線關系表明，DA抑制了電壓門控性鈣通道的開放，減小了鈣電流。通過給予150 pA、4 ms的電流注入，觀察細胞動作電位時程的變化，結果表明，DA通過抑制鈣電流，加快動作電位的復極化，明顯縮短了動作電位的時程。DA干預后，細胞內鈣離子濃度降低，這可能與電壓門控性鈣通道被抑制有關。

Fig 2 Effect of DA on level of intracellular Ca2+ concentration

A: The trace shows the changes of intracellular Ca2+concentration in a representative cell perfused with 2.8,16.7 and 16.7 G+DA(10 μmol·L-1);B:The mean value of ΔF340/F380(Fmax-F0)in response to different treatments as indicated(n=6).##P<0.01vs16.7G;**P<0.01vs2.8G. The change of intracellular calcium[ΔF340/F380(Fmax-F0)] was determined by subtracting the initial F340/F380 ratio from the maximum F340/F380 for each treatment

我們推測，DA可能是通過抑制了鈣通道影響了胰島素的分泌。由于β細胞的動作電位主要是由Ca2+通道和K+通道來產生的，是動作電位去極化和復極化的主要離子通道，而動作電位又可以直接調節胰島素的分泌活動。本次實驗證實了DA抑制了電壓門控性Ca2+通道，使得動作電位去極化幅度降低，復極增快，動作電位時程縮短，細胞的興奮性下降；同時也使細胞內Ca2+濃度下降，分泌囊泡與細胞膜融合缺乏動力，影響了囊泡的胞吐活動，最終抑制了胰島素的分泌活動。但關于K+通道是否也參與其中仍待進一步的研究。

(致謝：本文實驗在山西醫科大學藥理教研室章毅實驗室完成，在此對實驗人員表示感謝。)

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Effect of DA on insulin secretion from rat pancreatic cells and possible mechanism

ZHONG Xiang-qin1, DING Ya-qin1, REN Le-le1, BAI Tao1,2, LIU Meng-meng1, LIU Yun-feng2, ZHANG Yi1
(1.DeptofPharmacology,2.DeptofEndocrinologyoftheFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

Aim To investigate the effects of dopamine(DA) on insulin secretion from rat islets and the possible mechanism.Methods Pancreatic islets were obtained from the pancreatic of male SD rats by collagenase P digestion and histopaque-1077 density gradient separation. Insulin secretion experiment was used to observe the change of insulin release after DA treatments. As to study the potential mechanisms of the effects of DA, patch-clamp experiment and calcuim image technique were applied to test the depolarization-evoked Ca2+currents, action potential duration and intracellular Ca2+concentration.Results In 2.8 mmol·L-1glucose, DA had no effect on insulin secretion; in 16.7 mmol·L-1glucose, dopamine inhibited insulin secretion in a dose-dependent manner. DA inhibited the inward calcium current, shorten the action potential duration, and reduced the intracellular Ca2+concentration.Conclusion DA inhibits insulin secretion maybe by decreasing the inward calcium current leading to shorten the action potential duration and reduce the intracellular Ca2+concentration.

dopamine hydrochloride; islet β cell; insulin secretion; voltage-gated calcium channels; action potential; calcuim image technique

2016-12-11,

2017-01-20

國家自然科學基金資助項目(No 81670710，81373464，81273564，81270882);山西省留學回國人員科技活動項目擇優資助(No 2016-97);山西省自然科學基金資助項目(No 2013011047-3)

鐘向琴(1992-)，女，碩士生，研究方向：內分泌藥理學，E-mail:1246131750@qq.com; 章 毅(1971-)，男， 博士，教授，博士生導師，研究方向：內分泌藥理學，通訊作者，E-mail: yizhang313@163.com; 劉云峰(1973-)，女， 博士，副主任醫師，碩士生導師，研究方向：糖尿病的治療及發病機制，通訊作者，E-mail: nectarliu@163.com

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.026.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.013

A

1001-1978(2017)05-0653-04

R-332；R322.57；R347.8；R348.1；R971.93