凡納濱對蝦鈣網蛋白cDNA序列的克隆及組織表達分析

郜衛華　田羅　黃廷華　姚敏　許巧情

摘要：利用RACE技術，克隆了凡納濱對蝦鈣網蛋白（calreticulin，CRT）基因（GenBank登錄號：JQ682618）。該基因（LvCRT）cDNA全長1866 bp，含有1個長達1 221 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼的成熟肽由406個氨基酸組成，5′UTR（5′非編碼區）長度為222 bp，3′UTR長度為423 bp，3′端加尾信號AATAAA位于poly（A）尾巴上游27 bp處。預測其理論分子量是15.3 ku，等電點pI為4.90。具有1個保守的鈣網蛋白家族標簽（KHEQNIDCGGGYLKVF），1個信號肽（MKTWVFLALFGVVLVES）和保守的HDEL內質網回收標簽。經NCBI BLASTX比對表明，LvCRT基因與中國明對蝦和斑節對蝦的LvCRT具有高度的相似性和一致性。系統進化分析表明，LvCRT在親緣關系上更接近昆蟲的鈣網蛋白基因。熒光定量PCR結果顯示CRT在肌肉組織中表達量最低，在腸中的表達量最高。對凡納濱對蝦CRT基因全長cDNA序列克隆和表達的研究為更進一步了解CRT多肽在凡納濱對蝦中的重要功能奠定了基礎。

關鍵詞：凡納濱對蝦；鈣網蛋白；基因克隆；表達

中圖分類號：S917.4 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0036—05

鈣網蛋白（calreticulin，CRT）最初是由Ostwald等在兔肌肉細胞的糙面內質網中被發現的。近年來研究表明，CRT不僅存在于內質網腔中，在細胞表面和胞外基質中都有表達。Luan等研究表明，CRT在中國明對蝦（Fenneropenae-us chinensis）肝胰腺、鰓、肌肉、腸、淋巴器官、血細胞和卵巢中均有表達，其中卵巢的表達量最高。成熟的鈣網蛋白包括3個不同的功能結構域：N-功能域負責結構底物蛋白，P-功能域和C-功能域可以結合鈣離子并使這種結合更加穩定。目前為止，已公布的甲殼動物的鈣網蛋白序列包括中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis（DQ323054）、斑節對蝦Penaeus monodon（HQ259085）和克氏原螯蝦Pacifastacus leniusculus（HQ596362）。

作為內質網分子伴侶蛋白，鈣網蛋白除了在細胞功能中扮演重要的作用，如內質網鈣離子平衡和分子伴侶功能外，還參與了包括生長、繁殖、蛻皮、免疫功能、細胞凋亡和氧化及脅迫響應的多種生物學過程。本研究根據長期低鹽誘導消減cDNA文庫中差異表達基因的同源序列和RACE方法，克隆了凡納濱對蝦CRT（LvCRT）基因，并利用熒光定量PCR技術對其組織特異性表達進行了的分析，以期為凡納濱對蝦脅迫生理相關基因的克隆研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗動物

試驗用蝦購自廣東海興農生物科技有限公司，于廣東海洋大學東海島實驗基地水泥池暫養1周，取健康凡納濱對蝦，經滅菌DEPC水清洗后，先將其冰浴麻醉，冰浴條件下分離血細胞、肌肉、肝胰腺、腸道和鰓共5種組織，迅速裝入1.5 mLeppendoff離心管（RNase free），并立即投入液氮速凍，后轉移至-80℃冰箱保存備用。

1.2總RNA的提取

取凡納濱對蝦血細胞、肌肉、肝胰腺、腸道和鰓共5種組織，按照聯合基因的Unizol Reagent（GENEray biotechnology，China）的操作步驟，研磨、裂解組織后提取總RNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見分光光度計對提取的組織總RNA進行定性和定量檢測。

1.3 LvCRT cDNA全長克隆

1.3.1 LvCRT cDNA片段的獲得 根據構建的消減cDNA文庫得到的LvCRT的EST序列（146 bp）和中國明對蝦CRT保守序列，重新應用軟件Primer Premier 5.0設計正反向引物（LvCRTF1/LvCRTR1）克隆中間片段，本試驗中所有引物皆由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。PCR反應體系為20μL，反應條件為：95℃5 min；95℃60 s，57℃60 s，72℃60 s，35個循環；72℃10 min。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用PCR產物凝膠回收試劑盒（OMEGA，USA）回收擴增片段，回收后與Easy Digestion T-vector（pED-T）（Si-noBio，Shanghlai）載體連接，并轉入感受態細胞DH5α中。挑取陽性克隆菌落送往深圳華大基因公司測序，將所得LvCRT基因cDNA中間序列于NCBI中進行BLASTX同源性分析。

1.3.2 LvCRT cDNA 3′端和5′端的獲得 根據SMARTerTMRACE cDNA Ampllication Kit（Clontech，USA）和5′RACE Sys-tem for Rapid Amplification of cDNA ends（Invitrogen，USA）試劑盒操作步驟，分別擴增LvCRT基因cDNA的3′端和5′端序列，整個過程所需的引物序列見表1。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，接下來的DNA回收、連接轉化、測序和同源性比對等步驟均同“1.3.1”節。

1.3.3序列分析 采用BioEdit軟件將中間序列、3′端序列和5′端序列拼接得到LvCRT基因全長cDNA序列。設計正反向引物（LvCRTF/LvCRTR）對該基因進行ORF開放閱讀框克隆以確保全長的正確性。此過程采用Ex Taq DNA聚合酶，PCR反應條件：95℃4min；95℃40 s，57℃1 min，72℃1 min，35個循環；72℃10 min。冰箱4℃保存。接下來的DNA回收、測序和同源性比對等步驟均同“1.3.1”節，所用引物序列見表1。

1.3.4 LvCRT cDNA全長生物學信息分析 通過NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTX進行蛋白序列同源性檢索；通過http：∥expasy.pku.edu.cn網站上的ExPASy軟件對該cDNA全長進行序列開放閱讀框搜索、蛋白質分子量、等電點和氨基酸序列的推斷等；通過http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP網站上SignalP3.0軟件預測該基因的信號肽；通過Clustal W1.8軟件進行氨基酸多重序列分析，再結合MEGA 4.0軟件用鄰接法構建NJ系統樹（Neighbour-Joining tree）。

1.3.5實時熒光定量PCR分析 根據已克隆LvCRT基因和口一actin內參基因，使用Primer Premier 5.0軟件設計熒光定量表達的特異性正反向引物LvCRTF′/LvCRTR′和β-actinF′/β-actinR′（表1）。使用Fermentas RevertAidr^TMFirst StrandcDNA Synthesis Kit（MBI，LTU）試劑盒合成cDNA第一鏈。具體如下：在冰浴后PCR管中加入1μg總RNA和1μL Oligo-dT（15）（0.5μg/μL），然后再加入DEPC水配制成10μL體系，將反應管置于PCR儀中，70℃預變性5 min，迅速置于冰上。變性反應結束后再加入4μL5×First—strand緩沖液、2.0μL0.1 mo]/L DTF、1.0 μL RiboLock^TMRibonuclease inhib-itor和2.0μL dNTP mix（10 mmol/L）后將PCR管置于PCR儀中，37℃孵育5 min，再加入1μL SuperscriptⅡ（200 U/μL），將PCR管置于PCR儀中進行反應，42℃孵育50 min，70℃變性10 min，4℃保存。實時熒光定量PCR使用SYBRμPremix Ex Taq^TM（TaKaRa，Japan）試劑盒在ABI 7500 Real Time Thermal Cycler熒光定量PCR儀（Applied Biosystem美國應用生物系統）中進行，定量數據分析采用相對定量中的2-AACt法（Hvak和Schmittgen，2001）；使用SPSS 13.0軟件進行顯著性分析；用Turkey法進行多重比較分析。

2結果與分析

2.1 LvCRT全長cDNA序列的克隆及分析

以凡納濱對蝦肝胰腺cDNA為模板，采用分段克隆方法和3′RACE、5′RACE法對CRT基因全長cDNA序列進行克隆，得到全部中間序列（397 bp）（圖1）和3′末端（990 bp）、5′末端（742 bp）（圖2），采用BioEdit軟件去除重疊序列以及接頭序列后得到1866 bp的cDNA全長序列，將獲得的凡納濱對蝦LvCRT cDNA全長序列提交NCBI，GenBank登錄號為JQ68261 8。經http：∥au.expasy.org/tools/dna.htmL在線軟件分析顯示，該基因具有1個長達1 221 bp完整的開放閱讀框，1個起始密碼子（ATG）和1個終止密碼子（TAA），開放閱讀框編碼具有406個氨基酸的鈣網蛋白。基因5′端非編碼區（5′-UTR）長222 bp，3′端非編碼區（3′-UTR）長423 bp。3′端的加尾信號AATAAA位于poly（A）尾巴上游27 bp處。開放閱讀框進一步驗證結果表明cDNA全長序列的正確性（圖2）。經http：∥web.expasy.org/compute_pi/在線分析，該蛋白分子量為15.3 ku，等電點pI為4.90。

2.2 LvCRT cDNA特征的分析

用http：∥/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP網上SignalP3.0軟件在線預測該基因信號肽，結果顯示，該基因具有1個疏水信號肽（MKTWVFLALFGVVLVES），該信號肽位于氨基酸N端（圖3）。使用在線http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos軟件預測該基因蛋白磷酸化位點，預測結果顯示該蛋白共有22個磷酸化位點，其中5個為Ser磷酸化位點，其氨基酸位點分別為27、76、83、124、191；11個為Thr磷酸化位點，其氨基酸位點分別為50、66、77、94、139、179、222、229、246、298、344；6個為Tyr磷酸化位點，其氨基酸位點分別為126、180、269、283、297和304（圖4）。

通過NCBI網站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi）蛋白質保守區的結果顯示，推測LvCRT中第19～330個氨基酸殘基構成了1個由311個氨基酸組成的保守區，該保守區屬于鈣網蛋白家族。該基因還具有1個保守的鈣網蛋白家族標簽（KHEQNIDCGGGYLKVF），該標簽位于第95～111個氨基酸殘基之間。除此之外，還發現該基因具有1個鈣網蛋白家族的重復序列IxDxExxKPE（/D）DWD和1個保守的HDEL內質網回收標簽，這個內質網回收標簽位于氨基酸序列的c末端（圖5）。

2.3 LvCRT基因序列比對與系統發育分析

使用ClustalW 1.83和MEGA 4.0軟件，選取中國明對蝦（ABC50166），斑節對蝦（AD000927），克氏原螯蝦（AEC₅₀079），意蜂Apis mellifera（XP_392689），岡比亞按蚊Anophelesgambiae（AAL68781），家蠶Bombyx mot/（BAC57964），黑腹果蠅Drosophila melanogaster（CAA45791），斑馬魚Danio rerio（Np_956007），小鼠Mus musculus（AAH03453），人Homo sapi-ens（NP_004334），擬南芥Arabidopsis thaliana（NP_176030），煙草Nicotiana tabacum（CAA59694），非洲爪蟾Xenopus laevis（CAA47866）13個物種的CRT氨基酸序列與凡納濱對蝦的CRT氨基酸序列進行比對。分析顯示，凡納濱對蝦全序列與斑節對蝦（ADQ28317）、中國明對蝦（ABC50166）、克氏原螯蝦（AEC50079）和黑腹果蠅（AAF54416）分別具有99%、99%、94%和81%的序列相似度，99%、97%、89%和69%的序列一致性（圖6）。系統發育分析顯示，構建的分子進化樹可以將CRT基因聚類分為植物、脊椎動物和無脊椎動物3個分支，LvCRT位于無脊椎動物CRT的一支，與昆蟲的CRT聚類在一起（圖7）。

2.4 LvCRT基因在組織中的表達分布

熒光定量PCR分析結果顯示，LvCRT基因在凡納濱對蝦所檢測的組織包括肌肉、鰓、腸、肝胰腺和血細胞中均有表達（圖8），由高到低依次為：腸道>鰓>血細胞>肝胰腺>肌肉，腸道中表達量最高，顯著高于其他各組織；血細胞和肝胰腺問的LvCRT表達量無顯著性差異，但二者均顯著高于肌肉而低于鰓；肌肉表達量最低，顯著低于其他各組織。

3討論與結論

目前，鈣網蛋白的研究多集中在模式生物上，甲殼動物中鈣網蛋白的研究相當少。迄今為止，已公布的對蝦類鈣網蛋白序列僅包括中國明對蝦（DQ323054）、斑節對蝦（HQ259085）和克氏原螯蝦。

本研究以先前建立的鹽度脅迫誘導凡納濱對蝦消減cDNA文庫為PCR模板，成功克隆到凡納濱對蝦的鈣網蛋白LvCRT基因的cDNA全長序列，并對其進行了氨基酸的預測和同源序列的比對分析。LvCRT基因與斑節對蝦（ADQ28317）、中國明對蝦（ABC50166）和克氏原螯蝦（AEC50079）具有99%、99%和94%的序列相似度，99%、97%和89%的序列一致性。LvCRT基因推導的氨基酸序列具有1個311個氨基酸組成的高度保守區和1個高度保守的鈣網蛋白家族標簽（KHEQNIDCGGGYLKVF），這與欒偉報道的中國明對蝦FCCRT鈣網蛋白分子結構極為相似，即與底物結合的相關的N-和P-2個功能域都非常保守，據此推測，LvCRT可能與之前報道的鈣網蛋白具有相似的分子伴侶功能。系統發育分析顯示，LvCRT位于無脊椎動物CRT的一支，在親緣上接近于昆蟲的CRT。

以往的研究表明，鈣網蛋白作為重要的內質網分子伴侶蛋白，在病原感染、發育以及環境脅迫等情況下都對細胞起到重要的保護作用。鈣網蛋白最初被鑒定為一種內質網的鈣離子結合蛋白，之后其作為分子伴侶蛋白在內質網行使的眾多功能得到一一闡明。近期的研究結果又證明鈣網蛋白在免疫中扮演重要的作用，如吞噬、補體途徑、細胞粘連甚至自體免疫等過程。Johnson等研究表明，若缺乏CRT，小鼠胚胎的死亡會增高、細胞黏附活性會降低、細胞對凋亡的敏感度增加、心肌的非正常發育會增加、非折疊蛋白的積累和錯誤折疊會增加等。在哺乳動物中，CRT在炎癥反應和病原感染過程中起重要的作用。昆蟲中的CRT不僅參與早期的包囊作用，且很可能參與了昆蟲的免疫過程。Wang等在感染WSSV的中國明對蝦中，利用基因芯片技術發現CRT基因在感染6 h和瀕臨死亡的對蝦體內會顯著上調表達。Duan等在感染鰻弧菌和WSSV的脊尾白蝦中發現，血細胞和肝胰腺在感染第1個6 h后CRT轉錄水平表達量的上調表明其與免疫防御有關聯。欒偉發現在熱休克、重金屬脅迫和感染WSSV的中國明對蝦中，CRT轉錄表達會有明顯變化，且不同重金屬處理有不同的CRT轉錄表達模式。Visudtiphole等研究表明，斑節對蝦仔蝦血細胞的CRT基因在熱休克脅迫3 h后會顯著上調表達，可以作為斑節對蝦對熱應激的分子生物標記。結合本研究中鹽度脅迫的消減文庫中CRT基因的發現，表明LvCRT與環境脅迫之間存在一定關聯，未來可以作為一種環境脅迫或者種質改良的分子標記。