半枝蓮氯仿極性部位提取物促進人結腸癌細胞凋亡及其逆轉耐藥的機制研究

張鈴，方翌，蔡巧燕，林珊，魏麗慧，彭軍

（福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122）

半枝蓮氯仿極性部位提取物促進人結腸癌細胞凋亡及其逆轉耐藥的機制研究

張鈴，方翌，蔡巧燕，林珊，魏麗慧，彭軍

（福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122）

目的研究半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB）促進人結腸癌細胞的凋亡及其逆轉HCT-8／5-FU細胞對5-FU耐藥的機制。方法用ECSB干預結腸癌細胞株HCT-8，用Gexp技術檢測其細胞凋亡相關基因的表達；用5-FU、ECSB聯合5-FU干預耐藥細胞株HCT-8／5-FU，檢測其耐藥相關基因的表達。結果在ECSB干預48 h后，能顯著下調HCT-8的Bcl-2表達，并且升高Caspase 8的表達，但不影響Bax的表達；ECSB聯合5-FU給藥后，HCT-8／5-FU的LRP表達比5-FU給藥顯著下降。結論ECSB通過上調Bax／Bcl-2和Caspase 8的表達促進HCT-8細胞的凋亡，下調LRP的表達增強HCT-8／5-FU對5-FU的敏感性。

半枝蓮氯仿極性部位提取物；結腸癌；細胞凋亡；耐藥性

結腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是常見的惡性腫瘤，其女性發病率排名世界第二，男性發病率排名世界第三［1］。目前，治療結腸癌的主要方法為手術切除，但容易發生復發、轉移。結腸癌屬于復雜的系統性疾病，其發病原因涉及多通路、多靶點，而目前的一些化療藥物都是單靶點藥物，容易造成嚴重的毒副作用，并且耐藥率高，因此尋找有效低毒的化療藥物是目前研究的熱點。半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don）為我國傳統的抗腫瘤中草藥，其主要成分為黃酮類、二萜類化合物，還包括生物堿、甾體和多糖等［2］。在臨床上半枝蓮主要應用于治療肝癌、胃癌、直腸癌、食道癌、肺癌等，療效顯著。實驗研究表明半枝蓮通過抑制腫瘤生長、增強免疫功能、抗氧化和抗突變等發揮抗癌作用［3］。本課題前期研究發現：半枝蓮的四個極性部位提取物（氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚）均能有效抑制結腸癌細胞的生長，其中半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB）的作用最為顯著［4］，且ECSB還能增強耐5-FU細胞株對5-FU的敏感性，但具體作用機制不明確。因此本實驗進一步研究ECSB抑制人結腸癌細胞的生長及其逆轉耐藥性的作用機制。

1材料

1.1材料與細胞株半枝蓮購自福建中醫藥大學國醫堂。結腸癌HCT-8、HCT-8／5-FU細胞購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2試劑RPMI-1640培養基購自南京凱基生物科技發展有限公司；胰蛋白酶、胎牛血清、Trizol購自美國Invitrogen公司；引物合成、DEPC處理水購自上海生物工程有限公司；Taq酶購自美國Sigma公司；GenomeLabTM Gexp start kit試劑盒、分離膠、甲酰胺（SLS）、DSS-400均購自德國Beckman公司。1.3主要儀器CO2培養箱購自Heal Force公司；PCR擴增儀購自美國Bio-rad公司；GenomeLabTM Gexp遺傳分析系統購自德國Beckman公司。

2方法

2.1半枝蓮不同極性部位提取物的制備取500 g半枝蓮全草，粉碎后用85%乙醇回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取制備半枝蓮的不同極性部位，分別得到石油醚極性部位提取物（EPESB）、氯仿極性部位提取物（ECSB）、乙酸乙酯極性部位提取物（EEASB）、正丁醇極性部位提取物（ENBSB）。ECSB進一步用旋轉蒸發儀蒸干，獲得的浸膏用DMSO超聲溶解，配置成200 mg／mL溶液，4℃保存備用。在所有細胞實驗中的DMSO濃度均≤0.25%。

2.2細胞培養結腸癌HCT-8細胞經含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基（含100 U／mL青霉素和100 μg／mL鏈霉素）培養后，置37℃，5%CO2培養箱進行傳代培養。HCT-8／5-FU細胞除了在完全培養基中加入15 μg／mL 5-FU外，其余培養條件和HCT-8細胞一致。

2.3RNA的提取取對數生長期細胞，進行細胞計數，HCT-8以4×105個／孔接種于6孔板中，加入150 μg／mL ECSB干預48 h；HCT-8／5-FU以4×105個／孔接種于6孔板中，分別設置5-FU組（3200 μM）、5-FU＋ECSB低劑量組（3200 μM 5-FU＋50 μg／mL ECSB）、5-FU＋ECSB中劑量組（3200 μM 5-FU＋100 μg／mL ECSB）干預細胞48 h。48 h后，去上清液并用PBS洗滌3次，加入500 μL Trizol，吹打細胞，把液體轉至1.5 mL離心管，放置5 min；加入100 μL氯仿，劇烈振蕩，室溫放置3 min；4℃，12 000 rpm離心15 min；取上清液300 μL到新離心管中，加入250 μL異丙醇，輕搖，放置10 min；4℃，12 000 rpm離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀；4℃，12 000 rpm離心5 min，去掉上清，室溫放置5 min；酒精完全揮發后，用10～20 μL DEPC水溶解RNA。

2.4細胞基因表達檢測

2.4.1基因擴增采用10 μL的RT體系，其中含：2 μL 5×RT buffer，1 μL Mix下游引物（500 nmol／L），0.5 μL RT逆轉錄酶，2.5 μL KanR，2.5 μL（10 ng／μL）樣品，1.5 μL ddH2O。逆轉錄反應程序：48℃1 min，42℃1 h，95℃5 min，4℃hold。采用10 μL的PCR體系，其中含：2 μL MgCl2，2 μL PCR buffer，1 μL Mix上游引物（200 nmol／L），0.7 μL Taq酶，4.3 μL RT產物。PCR反應程序：94℃1 min（94℃30 s，55℃30 s，70℃1 min）×35個循環。

2.4.2毛細管電泳在上樣板的每個孔中均分裝30 μL的SLS＋DSS-400混合液，取1 μL PCR產物加入其中，用槍頭攪拌均勻，最后在每孔覆蓋一滴石蠟油。同時在緩沖液板中每孔加入8滴的分離緩沖液，上機選擇Frag-3分離方法進行毛細管電泳。

2.4.3Gexp試驗條件優化對引物濃度、模板含量進行RT-PCR條件的優化。設置3個內參基因（TBP、GAPDH、CYPLOPHOH），將其峰值求幾何均數，B細胞淋巴瘤／白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8（Caspase 8）、肺耐藥相關蛋白（LRP）的峰值與該幾何均數的峰值相除，得到基因表達的相對含量。

2.5統計學方法所有數據應用Excel 2003和DPS v6.55軟件進行分析處理，所有實驗數據均為計量資料，采用單因素方差分析。

3結果

3.1ECSB對HCT-8細胞凋亡相關基因的影響前期實驗表明：半枝蓮的四個極性部位提取物（EPESB、ECSB、EEASB、ENBSB）中ECSB對人結腸癌HCT-8細胞的生長抑制作用最顯著［5］，但具體機制不明確。因此，本研究在此基礎上初步探討ECSB抑制HCT-8細胞生長的作用機制。Bax／Bcl-2決定著細胞的凋亡，兩者表達量比的升高會直接導致細胞的程序性死亡。如圖1所示：ECSB干預結腸癌HCT-8細胞48 h后，能顯著降低Bcl-2的表達量，對Bax的表達量則無明顯影響。細胞凋亡的各種途徑還涉及Caspase蛋白，在ECSB干預后，Caspase 8的表達量升高。這些都提示ECSB能有效抑制結腸癌細胞生長的機制之一是通過促進細胞凋亡。

圖1ECSB對HCT-8細胞Bax、Bcl-2、Caspase 8表達量的影響

3.2ECSB對HCT-8／5-FU細胞耐藥相關基因的影響前期研究還發現：ECSB除了能有效抑制細胞生長外，還能增強耐5-FU細胞株對5-FU的敏感性，但具體作用機制仍不明確［6］。HCT-8／5-FU是由HCT-8細胞株在5-FU長期的誘導下所產生的耐藥株，因此，采用HCT-8／5-FU細胞株進行耐藥性的相關機制研究。腫瘤產生耐藥的作用機制非常復雜，其中涉及到LRP的異常表達。如圖2所示：HCT-8／5-FU在5-FU干預下，LRP表達量顯著提高，表明該細胞株對5-FU產生明顯的耐藥。而在ECSB聯合5-FU給藥后，HCT-8／5-FU的LRP表達量能顯著下調，這說明，ECSB逆轉HCT-8／5-FU細胞株耐藥可能是通過LRP所介導的通路。

圖2ECSB對HCT-8／5-FU細胞LRP表達量的影響

4討論

細胞凋亡是細胞程序性死亡（program cell death，PCD）中的一種，在腫瘤發生、發展以及治療過程中具有重要功能。目前認為細胞凋亡主要有外源性途徑和內源性途徑，外源性途徑即死亡受體途徑，內源性途徑包括線粒體途徑和內質網途徑。其中線粒體途徑還分為兩種類型：一是通過激活Caspase通路促進凋亡；二是不依賴Caspase途徑，而是通過線粒體釋放AIF（凋亡誘導因子）直接導致凋亡的發生。除了線粒體的AIF途徑外，其余的途徑均與Caspase有關，如死亡受體通路，可經由死亡受體（Fas、TNF等）于FADD結合激活Caspase 8，從而產生Caspase相關蛋白的級聯反應而促進凋亡的發生［7］。Bcl-2家族蛋白通過線粒體通路的信號傳導決定了細胞凋亡，其中Bcl-2維持線粒體膜的完整性阻止細胞色素C（CytC）的釋放而發揮抗凋亡作用。而Bax是一種促凋亡蛋白，也屬于Bcl-2家族，常以二聚體或多聚體的形式存在，其激活可破壞線粒體膜，釋放CytC，從而引起凋亡。本研究發現：在ECSB干預下，HCT-8的Caspase 8表達量顯著升高，同時能上調Bax／Bcl-2，這說明ECSB能通過多條途徑誘導細胞凋亡。

腫瘤耐藥（multidrug resistance，MDR）是現在化療失敗的主要原因之一，其作用機制非常復雜，不同腫瘤細胞對于同種藥物可能存在多種的耐藥機制，甚至同種腫瘤細胞對于相同的藥物都存在不同的耐藥機制。其中LRP表達于多種腫瘤細胞，介導了MDR的產生。LRP分子量為110KD左右，位于16號染色體短臂（16p13.12-16p11.2），與各種藥物的跨膜轉運有關，但其不屬于ABC轉運體超家族［8］。LRP可能通過以下機制介導MDR：可以阻止以細胞核為靶點的藥物進入核內甚至讓進入核內的藥物被泵出核外；亦能讓細胞質中的藥物轉運至囊泡，囊泡通過胞吐作用將藥物排出細胞外［9］。本研究表明：在5-FU干預下，HCT-8／5-FU的LRP表達量顯著升高，但ECSB能下調由5-FU導致的LRP表達量的上升，這說明ECSB能通過調控LRP來逆轉結腸癌對5-FU的耐藥性。但細胞產生耐藥的機制非常復雜，ECSB逆轉HCT-8／5-FU的耐藥性可能同時還涉及其他通路，需要后續的進一步研究。

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R285.5

A

1000-338X（2016）06-0037-03

2016-10－02

福建省自然科學基金項目（2015J01687）；福建省衛生廳青年科研項目（2014-2-29）；

張鈴（1986—），女，理學碩士，實驗師，主要從事中藥抗腫瘤機制研究。

彭軍（1969—），男，研究員，醫學博士，博士生導師。

E－mail：pjunlab@hotmail.com