MitoQ激活Nrf2抗氧化系統緩解高脂誘導的胰島素抵抗

展平，王思東，牛朋納，呂美玲，于志文，褚克丹

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

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MitoQ激活Nrf2抗氧化系統緩解高脂誘導的胰島素抵抗

展平，王思東，牛朋納，呂美玲，于志文，褚克丹

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

目的觀察米托蒽醌甲磺酸鹽（mitoquinone mesylate，MitoQ）改善高脂肪所致的胰島素抵抗作用并探討其改善胰島素抵抗的效應機理。方法將30只C57BL／6J雄性小鼠隨機分成低脂組（LFD組）10只、高脂組（HFD組）20只，分別給予低脂飼料、高脂飼料喂養12周后，采用葡萄糖耐量試驗（IPGTT）檢測胰島素抵抗模型，模型成功后，HFD組隨機選取10只進行米托蒽醌甲磺酸鹽灌胃干預（MitoQ組）。30 d后取胰島素敏感組織肌肉，用免疫印跡方法（Western blot，WB）檢測蛋白水平和磷酸化變化。結果在HFD誘導的小鼠胰島素抵抗模型中，MitoQ組可減少小鼠葡萄糖耐量并糾正高脂所致的胰島素信號蛋白PKBSer473磷酸化損害；MitoQ組改善HFD飼喂小鼠損害的Nrf2系統功能，促進Nrf2核轉位，同時明顯降低Nrf2抑制性蛋白Keap1的表達。結論線粒體抗氧化劑MitoQ通過增強肌肉Nrf2系統功能和胰島素信號水平，緩解高脂肪誘導的胰島素抵抗。

MitoQ；高脂；Nrf2；胰島素抵抗；肌肉

肌肉作為胰島素促進葡萄糖攝取的主要組織，其胰島素信號功能損害在胰島素抵抗（insulin resistance，IR）產生中起重要作用。不少研究表明：在高脂肪飼喂等能量攝入過度的情況下，線粒體超負荷代謝將會促使過氧化物或活性氧族（reactive oxygen species，ROS）的過度生成，造成線粒體源性氧化應激和胰島素信號傳導障礙［1］。而近年研究發現：體內主要的抗氧化系統核因子E2相關因子2（Nrf2）的抗氧化應激作用減弱，與過多氧化物一起參與IR［2-5］。Nrf2系統在氧化應激時激活，通過在胞漿與Keap1蛋白解偶聯，轉位至細胞核并促進多種抗氧化酶包括醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase1，NQO1］的轉錄表達。Keap1是促進Nrf2蛋白酶降解蛋白，通過減少Nrf2蛋白含量起到抑制Nrf2系統功能的作用［6］。

米托蒽醌甲磺酸鹽（MitoQ）是在上世紀90年代設計并合成的線粒體靶向抗氧化劑，它由具有抗氧化作用的輔酶Q和具有靶向作用的三苯基膦組成，兩部分通過含10個碳原子的脂肪鏈鏈接［7-8］。大量體內體外實驗表明：MitoQ具有抗氧化、抗腫瘤、對抗代謝綜合癥的藥理作用［9-11］。近幾年有研究發現：它還具有糾正糖耐量異常的作用［12-13］。本次研究通過飼喂小鼠高脂飼料誘導其胰島素抵抗，觀察小鼠肌肉組織胰島素信號系統PKBSer473蛋白、抗氧化系統核因子E2相關因子2轉錄因子（Nrf2）及下游調控蛋白NQO-1、胞質接頭蛋白Keap1含量變化，探討MitoQ對高脂肪誘導小鼠胰島素抵抗的作用和藥理作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑SPF級雄性C57BL／6J小鼠（體重16～18 g）、低脂飼料（含4.5%脂肪）、高脂飼料（含60%脂肪）購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［生產許可證號：SCXK（滬）2013-0002］，飼養于福建醫科大學實驗動物中心；MitoQ（中國Suzhou Vosun Chemical公司；胰島素（丹麥諾和諾德生物技術有限公司）；PKB、PKBSer473抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；NQO-1和Keap1抗體（美國Proteintech Group公司）；Nrf2、GAPDH（美國Santa Cruz公司）；二抗（美國Thermo Scientific公司）；BCA蛋白濃度測定盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2方法

1.2.1構建胰島素抵抗模型及MitoQ干預將8周齡SPF級雄性C57BL／6J小鼠，普通飼料適應性喂養1周后，隨機分為低脂組（LFD組，n＝10），高脂組（HFD組，n＝10）和MitoQ組（n＝10），LFD組給予低脂飼料，HFD組和MitoQ組給予高脂飼料喂養12周，期間每周進行體重及進食量稱量1次。12周后，葡萄糖耐量試驗檢測胰島素抵抗模型是否成功。模型成功后，MitoQ組予以MitoQ 435 mg／kg灌胃給藥，而LFD組和HFD組按體重灌胃等量生理鹽水。MitoQ組灌胃干預30 d后，進行葡萄糖耐量測定。

1.2.2取材3組小鼠在第30天灌胃后禁食12 h，給予腹腔胰島素注射（0.3 U／kg）。在注射15 min后立即脊椎脫臼處死并迅速取股四頭肌和腓腸肌組織并速凍于液氮，然后轉移至－80℃冰箱備用。

1.2.3蛋白提取裂解液提前放入冰箱預冷；取50～70 mg肌肉組織，加入已預冷的裂解液500 μl～700 μl勻漿；勻漿完成后，轉移到EP管，冰上放置30 min，期間每10 min渦旋1次，4℃，14 000 r·min-1離心10 min；棄沉淀，留上清液，按BCA法測定蛋白濃度。

1.2.4免疫印跡法（western blot）檢測分別取40 μg蛋白樣品于聚丙烯酞胺凝膠中進行電泳，電泳結束后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上；脫脂牛奶封閉2 h，分別加入相應的一抗（1∶1 000），冰上搖晃過夜；TBST洗4遍，每次5 min，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶5 000）搖床上室溫反應2 h；TBST洗4遍，每次5 min洗滌，ECL化學發光試劑（發光液∶穩定液＝1∶1）顯影。

1.2.5統計學方法所有數據采用SPSS 20.0統計軟件分析。計量資料屬于正態分布以x±s表示，采用方差分析檢驗。

2結果與分析

2.1MitoQ干預緩解胰島素抵抗作用高脂飼料飼喂12周后，HFD組小鼠體重明顯高于LFD組小鼠；藥物MitoQ干預30 d后，MitoQ組體重較HFD組體重有一定的增加作用，見圖1；高脂飼料干預12周后，HFD組小鼠糖耐量明顯損害，見圖2；MitoQ組小鼠血糖水平與HFD組比較顯著降低，見圖3。

圖13組小鼠體重變化比較圖

圖2高脂飼料造模12周后糖耐量實驗結果圖

而且，對小鼠肌肉胰島素信號蛋白PKBSer473的檢測結果可以看出，高脂飼喂明顯損害胰島素刺激的PKB磷酸化，而MitoQ則具有增強PKB磷酸化的作用，見圖4～圖5。

圖3MitoQ干預30 d后糖耐量實驗結果圖

圖43組小鼠肌肉胰島素信號變化圖

圖53組小鼠肌肉胰島素信號變化蛋白密度統計圖

2.2MitoQ可糾正高脂造成的Nrf2功能損害免疫印跡法檢測結果顯示：對于小鼠肌肉組織中Nrf2抗氧化系統，與HFD組相比，MitoQ組能顯著增加Nrf2含量和NQO-1含量；HFD組Keap1含量較LFD組明顯增加，而MitoQ組含量明顯降低，見圖6～圖7。

圖6Nrf2抗氧化系統相關信號蛋白圖

3討論

圖7Nrf2抗氧化系統相關信號蛋白密度統計圖

隨著高熱量攝入及體力活動減少的生活改變，能量過度儲存造成肥胖，而肥胖是造成IR和糖尿病發病率增高的重要因素。本研究顯示：肌肉作為胰島素最典型的靶組織之一，胰島素信號傳導損害是高脂造成糖耐量損害的重要原因。有研究顯示：線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可以通過調節線粒體氧化還原信號與脂質代謝，從而改善抑制高血脂癥和胰島素抵抗，糾正血糖代謝紊亂［12-13］，但其具體信號機理尚不十分明確。

Nrf2是體內最主要抗氧化還原系統，本課題組以往研究發現：在高脂飼料飼喂的IR模型小鼠，其體內Nrf2抗氧化系統功能受到很大程度上損害，而特異性激活Nrf2抗氧化系統功能可以預防并扭轉胰島素抵抗［14］。因此可以表明Nrf2抗氧化系統功能受損是產生胰島素抵抗的重要因素，并且很有可能成為治療胰島素抵抗的非常重要潛在藥物靶點［6］。本研究中我們還發現：高脂造成肌肉組織Keap1含量升高，而MitoQ抑制這一作用，因此，MitoQ可能通過抑制Keap1激活Nrf2功能。

Nrf2功能損害可以通過調控對氧化應激敏感的炎癥信號如NF-κB等，阻礙胰島素信號如胰島素底物蛋白（insulin receptor substrate，IRS）的功能［15］。此外，氧化應激可以造成內質網應激并促使JNK信號活化，后者亦可作用于IRS-1并抑制其信號傳導。因而，MitoQ通過抑制Keap1活化Nrf2作用的發現，為進一步闡明其緩解高脂誘導的PKB信號傳導損害和MitoQ的扭轉高血糖狀態提供了重要的分子作用機制線索。

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R285.5

A

1000-338X（2017）02-0048-03

2017-02-15

國家自然科學基金（81270886）

展平（1989—），女，碩士研究生，研究方向：中藥藥理學。

褚克丹（1963—），女，教授。E-mail：chukd5917@163.com；于志文（1961—），男，教授。E-mail：yuzhiwen@yahoo.com