1,2-二氯乙烷誘導(dǎo)骨破壞的實(shí)驗(yàn)研究

劉旭良，王 兵，劉貽運(yùn)，鄭介柏

（廣州市第十二人民醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510620）

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1,2-二氯乙烷誘導(dǎo)骨破壞的實(shí)驗(yàn)研究

劉旭良，王 兵，劉貽運(yùn)，鄭介柏

（廣州市第十二人民醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510620）

目的探討1，2-二氯乙烷誘導(dǎo)骨破壞的實(shí)驗(yàn)研究。方法3大鼠30只（雌雄各15只），隨機(jī)分成A、B、C共3組10只/組（雌雄比例為1:1），A組染毒濃度225 mg/m3，B組450mg/m3、C組為未染毒對(duì)照組。建模，8周后處死，行骨密度檢測(cè)，取左側(cè)股骨行病理學(xué)檢查并計(jì)算空骨陷窩細(xì)胞率，股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率、骨小梁寬度、最大脂肪細(xì)胞直徑每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量和單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量、熒光顯微鏡觀察并測(cè)定四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離；取右側(cè)股骨，測(cè)量骨灰重。結(jié)果與C組比較，A組和B組的骨密度和骨灰重、空骨陷窩細(xì)胞率，股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率、骨小梁寬度、最大脂肪細(xì)胞直徑每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量和單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量、四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離明顯降低（P＜0.05）；與B組比較，A組的骨密度和骨灰重、空骨陷窩細(xì)胞率，股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率、骨小梁寬度和單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量、四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離明顯降低，最大脂肪細(xì)胞直徑每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論1，2-二氯乙烷誘導(dǎo)后大鼠的骨密度等各項(xiàng)指標(biāo)出現(xiàn)明顯下降，而且隨著1，2-二氯乙烷濃度的增加，這些指標(biāo)下降更明顯，1，2-二氯乙烷可以誘導(dǎo)骨破壞。

1，2-二氯乙烷；骨密度；空骨陷窩細(xì)胞；骨灰重

二氯乙烷（dichloroethane，CH3CHCl2）是一種應(yīng)用廣泛的工業(yè)材料，但是其引起的中毒事件越來(lái)越多，因此對(duì)其毒性的研究也受到廣大學(xué)者的關(guān)注。1，2-DCE中毒后機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了大量的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），而ROS在致毒過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[1]。而將二氯乙烷應(yīng)用于對(duì)骨破壞的研究沒(méi)有見(jiàn)詳細(xì)的報(bào)道，因此本研究將1，2-二氯乙烷誘導(dǎo)大鼠的骨骼，從而確定1，2-二氯乙烷毒性對(duì)骨的破壞程度。

1 資料與方法

1.1 一般材料

30只雌雄大鼠（雌雄各15只），體質(zhì)量為201.2±18.9 g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1，2-二氯乙烷購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度：99.5%。

1.2 方法

1.2.1 建模分組

取大鼠30只（雌雄各15只），隨機(jī)分成A、B、C共3組10只/組（雌雄比例為1:1），A組染毒濃度225 mg/m3，B組450 mg/m3，C組為未染毒對(duì)照組。建立1，2-DCE中毒大鼠模型。同等條件下飼養(yǎng)，分別于0周、4周和8周時(shí)用DPXNT雙能骨密度儀檢測(cè)骨密度，8周檢測(cè)結(jié)束后處死所有大鼠，行病理學(xué)檢查并計(jì)算空骨陷窩細(xì)胞率。熒光顯微鏡觀察并測(cè)定四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離，取右側(cè)股骨，測(cè)量3組大鼠的骨灰重[2]。

1.2.2 骨密度的測(cè)定

采用DPX-NT雙能骨密度儀（美國(guó) Datex-Ohmeda，Inc生產(chǎn)，通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展（上海）有限公司提供，國(guó)食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2012第2301193號(hào)）對(duì)3組大鼠的骨密度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 病理學(xué)檢查并計(jì)算空骨陷窩細(xì)胞率，股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率、骨小梁寬度、最大脂肪細(xì)胞直徑每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量和單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量采集3組大鼠的左側(cè)股骨行進(jìn)行病理學(xué)分析，組織HE染色后用雙目Olympus光學(xué)顯微鏡分別在40×、100×、400×下觀察，攝像后進(jìn)行Image-pro-plus 圖像分析系統(tǒng)分析，分別測(cè)得股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率和骨小梁寬度，每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量。組織進(jìn)行Masson染色后采用100×光鏡下觀察骨小梁內(nèi)膠原分布情況，經(jīng)攝像后存于Image-pro-plus 圖像分析系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)中，測(cè)得單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)用SPSS 16.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。兩組間均數(shù)的比較采用成組t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠8周的骨密度和骨灰重比較

具體結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可知與C組比較，A組和B組的骨密度、四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離和骨灰重明顯降低（P＜0.05）；與B組比較，A組的骨密度、四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離和骨灰重明顯降低（P＜0.05）。

表1 3組大鼠8周的骨密度、四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離和骨灰重比較（s）

表1 3組大鼠8周的骨密度、四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離和骨灰重比較（s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

分組 骨密度（g/cm2） 骨灰重（%） 四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離（mm）A組 0.18±0.02 64.4±21.5 0.15±0.01 B組 0.16±0.01* 62.5±19.8* 0.11±0.01* C組 0.22±0.05*#66.9±25.6*#0.19±0.02*#

2.2 3組大鼠8周的病理學(xué)指標(biāo)

具體結(jié)果見(jiàn)表2，由表2可知與C組比較，A組和B組的空骨陷窩細(xì)胞率，股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率、骨小梁寬度和單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量明顯降低，最大脂肪細(xì)胞直徑每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量明顯增加（P＜0.05）；與B組比較，A組的空骨陷窩細(xì)胞率，股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率、骨小梁寬度和單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量明顯降低，最大脂肪細(xì)胞直徑每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量明顯增加（P＜0.05）。

表2 3組大鼠8周的病理學(xué)指標(biāo)（s）

表2 3組大鼠8周的病理學(xué)指標(biāo)（s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

分組 空骨陷窩細(xì)胞率（%） 股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率（%） 骨小梁寬度（μm） 空泡陷窩數(shù)量（個(gè)） 單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量（%）A組 7.02±1.06 52.9±10.5 70.9±16.9 7.89±1.04 41.9±10.2 B組 6.58±1.08* 48.9±12.5* 58.9±12.5* 9.84±1.24* 36.5±10.6* C組 7.98±1.21*#65.9±16.9*#93.6±21.8*#0.48±0.11*#57.9±18.9*#

3 討 論

骨量減少和股骨頭缺血性壞死是兩種較常見(jiàn)的疾病，一旦發(fā)生便可能帶來(lái)難以逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重后果。二者在病變發(fā)展過(guò)程中會(huì)表現(xiàn)出相似的病理學(xué)改變，如骨細(xì)胞變性壞死，空骨陷窩數(shù)量逐漸增加[4]。骨細(xì)胞變形壞死、肥大的同時(shí)，將形成類(lèi)似占位性病變，也可以導(dǎo)致骨內(nèi)壓增高，間接導(dǎo)致骨壞死[5]。目前臨床治療1，2-DCE中毒患者時(shí)均常規(guī)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，部分患者被觀察到骨破壞，對(duì)此的解釋多歸因于糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)，而1，2-DCE在其中是否起到了作用則未見(jiàn)有相關(guān)研究。事實(shí)上，雖然糖皮質(zhì)激素確實(shí)具有肯定的骨破壞誘導(dǎo)作用，但許多對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松和股骨頭缺血性壞死的研究也表明，除了糖皮質(zhì)激素以外，原發(fā)病也參與了骨破壞的誘導(dǎo)過(guò)程。有研究[6]顯示1，2-DCE中毒患者進(jìn)行糖皮質(zhì)激素治療后，而骨破壞發(fā)生率卻反而明顯較高，這說(shuō)明了1，2-DCE參與了誘導(dǎo)骨破壞的過(guò)程。

本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)采用不同濃度的1，2-DCE對(duì)大鼠進(jìn)行喂食，處理8周后1，2-DCE的大鼠的骨密度和骨灰重、空骨陷窩細(xì)胞率，股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率、骨小梁寬度、最大脂肪細(xì)胞直徑每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量和單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量、四環(huán)素雙標(biāo)記之間的距離明顯降低，而且隨著1，2-DCE濃度增加，降低更明顯。

1，2-DCE中毒后機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了大量ROS，而ROS可誘導(dǎo)骨破壞形成，數(shù)據(jù)顯示1，2-DCE中毒后骨破壞的發(fā)生率較高[7]。由此1，2-DCE可以通過(guò)ROS的作用誘導(dǎo)骨破壞的形成，而自由基清除劑可抑制這一過(guò)程。本研究將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。1，2-DCE中毒后發(fā)生的骨破壞常帶來(lái)嚴(yán)重的后果，因此本研究具有重大臨床意義和良好的社會(huì)效應(yīng)。

綜上所述，1，2-二氯乙烷誘導(dǎo)后大鼠的骨密度等各項(xiàng)指標(biāo)出現(xiàn)明顯下降，而且隨著1，2-二氯乙烷濃度的增加，這些指標(biāo)下降更明顯，1，2-二氯乙烷可以誘導(dǎo)骨破壞。

[1] Niatsetskaya ZV,Sosunov SA,et al.The oxygen free radicals originating from mitochondrial complex I contribute to oxidative brain injury following hypoxia-ischemia in neonatal mice.[J].J Neurosci.2012,32(9):3235-44.

[2] 劉旭良,李斯明.1,2-二氯乙烷中毒糖皮質(zhì)激素治療后骨量減少與血脂、血鈣相關(guān)性研究[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志.2013,19(4):349-351.

[3] 劉旭良,李斯明.1,2-二氯乙烷中毒糖皮質(zhì)激素治療后骨量減少臨床研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志.2013,23(15):65-69.

[4] 楊亞軍,崔 燎,FoxO/Wnt通路在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松中的調(diào)控機(jī)制[J]中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2013,29(1):27-30.

[5] Yin H,Zhu M.Free radical oxidation of cardiolipin:chemical mechanisms,detection and implication inapoptosis,mitochondrial dysfunction and human diseases.[J].Free Radic Res,2012,46(8):959-74.

[6] Hayatullina Z,Muhammad N,et al.Virgin coconut oil supplementation prevents bone loss in osteoporosis rat model.[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2012,23(7):236-239.

[7] Nazrun AS,Norazlina M,et al.The anti-inflammatory role of vitamine in prevention of osteoporosis.[J].Adv Pharmacol Sci,2012,14(2):702-709.

本文編輯：王雨辰

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ISSN.2095-8242.2017.010.1803.02

2014年度廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱(chēng)：1,2-二氯乙烷誘導(dǎo)骨破壞的實(shí)驗(yàn)研究，項(xiàng)目編號(hào)：20141A010042）