新型Rho激酶抑制劑WAR5抑制APP/PS1小鼠炎性反應的作用研究

吳 昊，辛延樂，谷青芳，于婧文，姜維佳，柴 智，肖保國,4，尉杰忠*，馬存根,*

（1.山西醫科大學第一臨床醫學院神經內科，山西 太原 030001；2.山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；3.山西中醫學院“2011”協同創新中心/神經生物學研究中心，山西 太原 030024；4.復旦大學華山醫院神經病學研究所，上海 200025）

新型Rho激酶抑制劑WAR5抑制APP/PS1小鼠炎性反應的作用研究

吳 昊1,2，辛延樂1,2，谷青芳2，于婧文2，姜維佳3，柴 智3，肖保國2,4，尉杰忠2*，馬存根1,2,3*

（1.山西醫科大學第一臨床醫學院神經內科，山西 太原 030001；2.山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；3.山西中醫學院“2011”協同創新中心/神經生物學研究中心，山西 太原 030024；4.復旦大學華山醫院神經病學研究所，上海 200025）

目的探討新型Rho激酶抑制劑WAR5對阿爾茨海默病（ Alzheimer disease，AD）的治療效果及其作用機制。方法雌性APP/PS1雙轉基因小鼠（鼠齡8月），隨機分為AD組和WAR5治療組。WAR5組腹腔注射WAR5化合物，AD組腹腔注射生理鹽水，持續2個月。水迷宮實驗檢測各組小鼠的認知功能；免疫熒光，Western blot技術檢測AD相關病理及炎癥信號通路的變化，包括Aβ，p-tau，TLR4和p-NF-κB。結果與AD組比較，WAR5治療能有效改善APP/PS1雙轉基因小鼠認知功能，減少AD標志性病理產物Aβ，p-tau的產生（P＜0.05）。同時能夠下調中樞神經系統內TLR4（P＜0.05），p-NF-κB的表達水平（P＜0.05）。結論WAR5對APP/PS1雙轉基因小鼠認知功能改善有效。WAR5可能成為治療AD的一個候選藥。

WAR5化合物；阿爾茨海默病；Rho激酶抑制劑；磷酸化核轉錄因子-κB

在進入老齡化社會后，阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）越來越受關注。β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）是老年斑（Senile plaques，SP）的核心成分，與胞內過度磷酸化Tau蛋白聚集形成的神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）共同為AD關鍵病理產物。有研究表明，Toll樣受體／核因子-κB信號通路激活參與AD腦內的炎癥反應，已發現其高表達與病理產物Aβ的聚集呈正相關[1,2]。Rho/Rho激酶（Rho kinase，ROCK）作為機體內廣泛存在的一種信號傳遞通路，參與炎癥反應、細胞凋亡等生命活動。近來研究發現，在AD時有ROCK的激活和表達，而應用ROCK抑制劑進行干預后均可改善臨床癥狀和病理狀況[3]。WAR5是本實驗室使用的一種新型的Rho激酶抑制劑[4]，本實驗主要探討了WAR5對APP/PS1雙轉基因小鼠的治療效果及對TLR4與磷酸化NF-κB的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

水迷宮軟件SMART V3.0及硬件購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；酶標儀購買于Thermo公司；凝膠成像分析儀購自Bio-Rad；BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天生物技術有限公司；一抗Aβ，p-tau，TLR4，p-NF-κB和β-actin等抗體購自cell signaling，Western blot二抗購自cell signaling，免疫組化二抗購自cell signaling；冰凍切片機購自Leica；WAR5化合物由天津紅日藥業股份有限公司提供。

研究對象：8月齡，體重26～28 g，雌性APP/PS1雙轉基因小鼠

1.2 主要方法

1.2.1 動物分組及給藥處理

雌性APP/PS1雙轉基因小鼠在潔凈級動物室正常喂養，隨機分為AD組和WAR5組，每組8只，WAR5組腹腔注射WAR5化合物2個月（40 mg/kg/天），AD組腹腔注射相同劑量生理鹽水。

1.2.2 水迷宮實驗

水迷宮硬件設備是由直徑為80 cm的圓形水池及直徑為9 cm的站臺組成，水溫（25.0±0.5）℃，液面高出平臺區（即SW區）2 cm。整個水迷宮硬件設備分為4個象限（NW，NE，SW，SE）和八個區域（Border NW zone，Internal NW zone，Border NE zone，Internal NE zone，Border Internal SW zone，Border SE zone，Internal SE zone），平臺在SW區。

學習訓練：周期為5天，每天上下午各一次，將小鼠從東西南北四個方向隨機放入水池，訓練小鼠從起點到達平臺，時長60 s/次；如果在60 s期間小鼠不能成功到達平臺，則進行引導，小鼠在平臺停留60 s。

認知功能測定：訓練結束后，進行5天的認知功能測定，將小鼠從東西南北四個方向隨機放入水池，自由游動60秒，SMART V3.0系統控制的攝像頭跟蹤并記錄以下指標：在平SW區活動度占總活動度的比例（Global Activity in SW （%））、入水到平臺時間（Latency to Target）、到平臺路徑距離（Mean Distance to Target）、第一次到達SW區時間（Latency 1st Entrance to SW）、在SW區滯留時間占總時間的比例（Time in SW（%））、在SW區路徑距離占總路徑距離的比例（Distance in SW （%））。

1.3 標本采集

行為學實驗后，0.3%戊巴比妥鈉麻醉，生理鹽水心臟灌注，各組4只取腦組織，提取蛋白，BCA定量，用于Western blot；其余小鼠生理鹽水灌注，4%多聚甲醛灌流固定，分離腦，經10%、20%和30%蔗糖溶液梯度24小時脫水，OCT包埋，以10 μm厚度做冠狀位冰凍連續切片，用于免疫熒光染色。

Western blot 蛋白樣品（30 μg）與等體積的2×Laemnli上樣緩沖液混勻，100 °C水浴5 min，10% SDS-PAGE不連續凝膠電泳分離。40 V濕式電轉移2 h。PVDF 膜于5%脫脂牛奶封閉2 h。用5%脫脂牛奶分別稀釋抗Aβ（1:1000）、抗p-tau（1:1000）、抗TLR4（1:1000）、抗p-NF-κB（1:1000）及抗β-actin（1:10000），分別加至膜上，4℃孵育過夜。次日1:10000稀釋相應熒光偶聯的二抗，室溫孵育2 h。洗膜5 min，3次，Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測染色條帶，以檢測蛋白條帶灰度與內參照β-actin 的灰度比值表示。

1.4 免疫熒光染色

冰凍切片經1×P B S洗5 m i n，3次；染抗A β（1:1000）、抗p-tau（1:1000）、抗TLR4（1:1000）、抗p-NF-κB（1:1000）；4℃孵育過夜；次日1×PBS洗5 min，3次；AlexaFlour 555或AlexaFlour 488熒光標記的二抗室溫孵育2 h；1×PBS洗5 min，3次，50%甘油封片鏡檢。

1.5 統計學處理

數據用均數±標準差（mean±SD）來表示，采用GraphPad Prism 5.0統計軟件進行處理。組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 WAR5改善APP/PS1雙轉基因小鼠的認知功能

通過分析水迷宮實驗的數據，我們發現，兩組動物在Global Activity in SW （%）（圖1a）沒有變化，說明兩組小鼠不存在體能上的差異。但是，WAR5治療后，小鼠的Latency to Target（圖1b）、Mean Distance to Target（圖1c）以及Latency 1st Entrance to SW（圖1d）均明顯減少；Time in SW（%）（圖1e）明顯增加、Distance in SW （%）（圖1f）明顯增加。

圖1 不同組別動物行為學測試6項指標統計學比較

2.2 WAR5減少Aβ與p-tau的在中樞神經系統的表達

如圖2a和2b所示，WAR5治療可明顯抑制Aβ和p-tau的表達 ；Western blot實驗結果進一步證明WAR5治療明顯降低Aβ與p-tau在小鼠腦組織中的表達（圖2c）。

圖2 不同組Aβ與p-tau免疫熒光染色及統計計數和Aβ與p-tau的Western blot結果

2.3 WAR5抑制TLR4與p-NF-κB的表達

本實驗通過免疫熒光和Western blot技術進一步檢測WAR5對該信號通路的影響，結果顯示：WAR5治療明顯降低TLR4、p-NF-κB的表達（圖3）。

圖3 不同組p-NF-κB免疫熒光染色及統計計數和TLR4與p-NF-κB的Western blot結果

3 結 論

Rho激酶抑制劑可減少Aβ1-42 的產生[5]。作為臨床上常用的ROCK激酶抑制劑，法舒地爾主要用于血管痙攣方面的治療，后來研究發現其還具有抑制炎癥、清除自由基及調控細胞活動等作用[6]。但卻存在治療的安全窗比較小、不易長期使用等諸多限制，因此選用一個副作用小，療效確切的新型藥物成為當務之急，本實驗所選用的WAR5化合物是法舒地爾的異構體，有研究表明，WAR5與法舒地爾相比，可減少小鼠CNS內CD68+巨噬細胞和CD4+T細胞的浸潤，推測WAR5可減少炎性細胞跨內皮細胞遷徙，減少BBB通透性，從而改善小鼠癥狀；并且WAR5擴血管作用小且治療安全窗大[7]。因此我們可以推測，在安全且有效的劑量（40 mg/kg/天）使用范圍內，WAR5治療AD模型小鼠也具有安全窗大、給藥后動物的存活率高等優點[4]

因此本實驗探討WAR5對AD的治療效果和機制具有重要意義。AD臨床上有明顯的記憶和認知功能的損傷，并且進行性加重。水迷宮實驗顯示，AD組和WAR5組在到達平臺區域的時間和距離以及活動的頻率存在明顯統計學差異，各項指標中WAR5組表現均優于AD組，說明WAR5可明顯改善AD小鼠的認知和記憶能力。

AD病因和發病機制較為復雜，有研究表明Aβ的沉積可通過影響Tau蛋白的磷酸化促進NFTs的產生[8]。在炎癥的環境下，神經元細胞也有可能通過自身代謝產生更多的Aβ，進一步擴大炎癥反應[9]。TLRs/NF-κB信號通路激活所引起的炎癥反應可能是AD發病中炎癥損傷的一種重要機制。在AD病理中，Aβ沉積引起TLR4的表達增加，并且誘導NF-κB的激活，進一步加重組織損傷[10-11]。通過藥物抑制TLRs/ NF-κB信號通路激活，降低機體炎癥損傷已成為治療AD的重要靶點，我們的實驗結果顯示WAR5可以明顯降低APP/ PS1雙轉基因小鼠腦內Aβ和p-tau，TLR4/NF-κB蛋白的表達，預示WAR5在治療AD方面具有一定的潛能。

綜上所述，新型Rho激酶抑制劑WAR5對阿爾茨海默病的免疫炎癥反應有明顯的臨床治療和癥狀改善作用，包括改善了小鼠的認知和記憶能力，減少了AD的病理產物，對炎癥反應進行了抑制。這可能為進一步探索AD損傷CNS后神經功能的恢復及其調控方法提供實驗依據。

[1] Lue LF,Kuo YM,Beach T,et al.Microglia activation and antiinflammatory regulation in Alzheimer’s Disease[J].Mol Neurobiol,2010,41:115-128.

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[4] Li YH,Yu JZ,Xin YL,et al.Protective effect of a novel Rho kinase inhibitor WAR-5 in experimental autoimmune encephalomyelitis by modulating infammatory response and neurotrophic factors[J]. Experimental and Molecular Pathology,2015,99(2):220-228.

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本文編輯：吳玲麗

Suppressive effect of WAR5,a novel Rho kinase inhibitor,on the infammatory responses of AD mice

WU Hao1,2, XIN Yan-le1,2, GU Qing-fang2, YU Jing-wen2, JIANG Wei-jia3, CHAI Zhi3, XIAO Bao-guo2,4, YU Jie-zhong2, MA Cun-gen1,2,3
(1.Department of Neurology, the First Clinical Medical College of Shanxi Medical University, Shanxi Taiyuan 030001, China; 2.Institute of Brain Science of Shanxi Datong University, Shanxi Datong 037009, China; 3."2011" Collaborative Innovation Center/Research Center of Neurobiology Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Shanxi Taiyuan 030024,China; 4.Institute of Neurology,Fudan University Huashan Hospital, Shanghai 200025, China)

ObjectiveTo explore the therapeutic effect and and mechanism of a novel Rho kinase inhibitor WAR5 on alzheimer disease (AD).MethodsFemale APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into AD group and WAR5 group when mice grow to 8 months.The AD group received intraperitoneal injection by saline for 2 months,while the WAR5 group given the WAR5 compound during the same time.We used the Morris water maze test to measure the cognitive competence of each group.Then we used to immunofluorescence method and Western blot experiment to test changes of the relevant pathological and inflammatory signal pathways,such as Aβ,ptau,TLR4 and p-NF-κB.ResultsThrough the treat of WAR5,there is a better spatial learning and memory,WAR5 reduce the symbolic pathological products of AD,including Aβ,p-tau (P＜0.05),and reduce the expression level of TLR4,p-NF-κB in central nervous system (P＜0.05).ConclusionThe novel Rho kinase inhibitor WAR5 is effectively improve function of spatial learning and memory in APP/PS1 transgenic mice,thus WAR5 may be a candidate drug to treat the AD.

WAR5 compound; Alzheimer disease; Rho kinase inhibitor; P-NF-κB

R320.54

B

ISSN.2095-8242.2017.010.1805.03

國家自然科學基金（81272163、81471412）；山西省回國留學人員重點科研資助項目（2014-重點7）；山西省大同市科技局基礎研究計劃項目（2014105-1）

尉杰忠（1975-），男，副教授，碩士生導師

通訊作者：馬存根（1960-），男，博士，教授，博導，E-mail：macungen2001@163.com