Notch信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的意義

田 偉，張 娟

（邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

Notch信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的意義

田 偉，張 娟

（邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

目的探索Notch信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的意義，以期為臨床提供實(shí)踐價(jià)值。方法選取我院2015年1月～2016年12月間接治的30里人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)患者作為本次研究對象，利用免疫磁珠法對人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行提取和分離，并進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)利用免疫組法以及熒光定量PCR對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，探索Notch信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中機(jī)制。結(jié)果經(jīng)分析對比發(fā)現(xiàn)，正常腦組織的NOTCH-1蛋白陽性區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白雷擊光密度值為（296.1±28.4），低度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白累積光密度為（5038±119.8），高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白累積光密度為（12001±137.8）.相比于正常腦組織患者而言，高度和低度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白表達(dá)水平明顯偏高，且高度惡性膠質(zhì)瘤患者明顯高于低度惡性膠質(zhì)瘤患者NOTCH-1蛋白表達(dá)水平，NOTCH-1、CBF-1以及HES-1基因在CD133+中表達(dá)水平均明顯高于在CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞，上述差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Notch信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的表達(dá)水平高，在人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過程中對NOTCH-1、CBF-1以及HES-1等關(guān)鍵基因具有重要的調(diào)控作用，對于治療膠質(zhì)瘤具有積極的意義。

Notch信號通路；膠質(zhì)瘤；干細(xì)胞上皮間；意義

Notch基因在不同脊椎動物和無脊椎動物中均具有較高的表達(dá)，且在基因結(jié)構(gòu)上具有較強(qiáng)的保守性，對于細(xì)胞發(fā)育以及增值分化過程中具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。臨床醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)干細(xì)胞以及前體細(xì)胞分化增殖過程中，NOTCH-1信號通路發(fā)揮關(guān)鍵作用。而針對Notch信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的相關(guān)研究較少。為此，本文選取我院接治的30例人腦膠質(zhì)瘤患者作為本次研究對象，利用免疫磁珠法對人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行提取和分離，并進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)利用免疫組法以及熒光定量PCR對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，探索Notch信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中機(jī)制。具體研究報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2015年1月～2016年12月間接治的30里人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)患者作為本次研究對象，其中男性17例，女性13例，年齡在23～68歲，平均年齡為（43±3.1）歲，低度惡性膠質(zhì)瘤和高度惡性膠質(zhì)瘤患者分別為15例。此外選擇同期20例接受顱內(nèi)減壓術(shù)治療患者的正常新鮮腦組織作為參照，其中本次研究所用的CHG-5膠質(zhì)瘤細(xì)胞株以及U251惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株均由我院細(xì)胞室培養(yǎng)。

1.2 方法

利用免疫磁珠法對人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行提取和分離，并進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)利用免疫組法以及熒光定量PCR對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。具體包括以下內(nèi)容：①細(xì)胞培養(yǎng)：采用免疫磁珠法對膠質(zhì)瘤新鮮樣本、CHG-5以及U251細(xì)胞株進(jìn)行分選，隨后在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)分離出的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，并將含血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)液，每瓶細(xì)胞數(shù)控制在1×105個(gè)，培養(yǎng)溫度設(shè)定在37℃，二氧化碳濃度控制在5%、濕度控制在95%，培養(yǎng)基換液時(shí)間每隔2天一次，持續(xù)培養(yǎng)5d，待細(xì)胞傳代并生長正常后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；②NOTCH-1信號通路基因表達(dá)檢測：借助熒光定量PCR法檢測NOTCH-1信號通路相關(guān)基因檢測，同時(shí)對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的總RNA進(jìn)行Trizol法予以提取，對HES-1、NOTCH-1以及CBF-1基因進(jìn)行檢測，其中選取GAPDH作為內(nèi)參基因；③檢測NOTCH-1蛋白的表達(dá)：對正常人腦組織標(biāo)本以及人腦膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行病理學(xué)冰凍切片，采用SBC方法免疫組化染色NOTCH-1蛋白，待染色完成后，借助顯微鏡對其進(jìn)行切片檢測，其中陽性區(qū)域?yàn)樽攸S色，并對陽性區(qū)域進(jìn)行ImagProPlus6.0測定其累計(jì)光密度值。

1.3 療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

對比分析正常人腦組織中的NOTCH-1蛋白表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤組織NOTCH-1表達(dá)，同時(shí)對NOTCH-1信號通路相關(guān)基因在人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過程中的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本次研究全部數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0處理分析，其中計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（s）表示，并以t檢驗(yàn)，其中組間差異顯著（P＜0.05），表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同腦組織切片蛋白表達(dá)對比

經(jīng)分析對比發(fā)現(xiàn)，正常腦組織的NOTCH-1蛋白陽性區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白雷擊光密度值為（296.1±28.4），低度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白累積光密度為（5038±119.8），高度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白累積光密度為（12001±137.8）。相比于正常腦組織患者而言，高度和低度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白表達(dá)水平明顯偏高，且高度惡性膠質(zhì)瘤患者明顯高于低度惡性膠質(zhì)瘤患者NOTCH-1蛋白表達(dá)水平，上述差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過程中NOTCH-1信號通路在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化情況

隨機(jī)抽取2株膠質(zhì)瘤細(xì)胞，對比同株膠質(zhì)瘤分離得到的CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞。其中兩株膠質(zhì)瘤細(xì)胞均來源于病例分型，分別為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Ⅳ級和星型細(xì)胞瘤Ⅱ級，此外對比CHG-5細(xì)胞株以及U251細(xì)胞株，結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，NOTCH-1、CBF-1以及HES-1基因在CD133+中表達(dá)水平均明顯高于在CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞，且差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 NOTCH信號通路人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化情況（s）

表1 NOTCH信號通路人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化情況（s）

類別 NOTCH-1 HES-1 CBF-1 CD133- CD133+ CD133- CD133+ CD133- CD133+星型細(xì)胞瘤Ⅱ級 1.0 5.5±1.3 1.0 6.0±0.8 1.0 7.4±1.5多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Ⅳ級 1.0 6.0±1.2 1.0 4.8±1.0 1.0 4.6±0.7 U251細(xì)胞株 1.0 7.8±1.6 1.0 4.1±0.7 1.0 4.3±0.8 CHG-5細(xì)胞株 1.0 10.4±1.8 1.0 4.7±1.1 1.0 5.1±0.9

3 討 論

膠質(zhì)瘤是臨床上一種危害性較大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，且病情惡化迅速，對患者的生命帶來極大的威脅。但臨床對于膠質(zhì)瘤的治療通常包括化療、放療以及外科手術(shù)或者免疫抑制治療等方法，且效果不甚理想。為進(jìn)一步探索NOTCH信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的機(jī)制，從而為治療人腦膠質(zhì)瘤提供新的解決方案。通過本文的研究不難發(fā)現(xiàn)，比于正常腦組織患者而言，高度和低度惡性膠質(zhì)瘤患者的NOTCH-1蛋白表達(dá)水平明顯偏高，且高度惡性膠質(zhì)瘤患者明顯高于低度惡性膠質(zhì)瘤患者NOTCH-1蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），NOTCH-1、CBF-1以及HES-1基因在CD133+中表達(dá)水平均明顯高于在CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞，且差異顯著（P＜0.05），Notch信號通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的表達(dá)水平高，在人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過程中對NOTCH-1、CBF-1以及HES-1等關(guān)鍵基因具有重要的調(diào)控作用，對于治療膠質(zhì)瘤具有積極的意義。

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本文編輯：吳玲麗

R739.41

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ISSN.2095-8242.2017.010.1859.02

河北省衛(wèi)生廳青年基金資助項(xiàng)目（20150036）