來源于Cronobacter universalis的植酸酶酶學性質的研究

付曉燕，韓紅娟，朱 波，王 波，彭日荷 ，姚泉洪

（上海市農業科學院生物技術研究所，上海 201106）

來源于Cronobacter universalis的植酸酶酶學性質的研究

付曉燕，韓紅娟，朱 波，王 波，彭日荷 ，姚泉洪

（上海市農業科學院生物技術研究所，上海 201106）

按照畢赤酵母（Pichia pastoris）對密碼子的選擇偏向性，對來源于細菌（Cronobacter universalis）的植酸酶基因（以下命名為CuPhyS）進行了密碼子優化改造，合成并且作為外分泌蛋白成功地在畢赤酵母GS115里表達，CuPhyS的蛋白分泌量可積累到45μg/mL。酶學性質研究表明：該酶的最適pH為4.0，最適溫度為50℃，在pH 3.0—12.0時該酶比較穩定，在50℃下熱穩定性較高；以植酸鈉作為底物，Mg2＋對酶活有一定的激活作用，Cu2＋對酶活有一定的抑制作用；該酶還具有良好的抗胰蛋白酶水解的能力和部分抗胃蛋白酶水解的能力。

植酸酶；Cronobacter universalis；畢赤酵母；酶學性質

植酸酶（Phytase，E.C.3.1.3.8）是一種能降解植酸及其鹽類的水解酶。常用于動物的飼料添加劑，存在于植物、動物、真菌以及微生物中。植酸酶的應用可以提高植物性飼料中磷的利用率，減少糞便中磷的排放量，從而降低環境中的磷污染，并可降低植酸的抗營養作用［1］。在富含磷的油料、谷物等植物性飼料中，有80%以上的磷是以植酸或植酸鹽的形式存在［2］。迄今，植酸酶的研究已比較全面，主要集中在識別植酸酶的種類，改善植酸酶的酶學特性，研究其催化機制及其增加植酸酶產量［3］。植酸酶作為一種飼料添加劑，有著廣泛的應用前景。但由于天然來源的植酸酶或者提取困難、或者分泌量太低、或者成本太高，難以滿足現實實驗和生產的需要。構建基因工程菌作為一個微型生物反應器來獲得能高效表達植酸酶的菌株，成為解決這一問題的途徑。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統是目前使用最廣泛的外源蛋白真核表達系統，其外源蛋白質的表達量可達到g/L的水平，實現植酸酶基因在畢赤酵母中的高效表達將大幅度提高植酸酶的發酵效價，進一步降低植酸酶生產成本。本研究根據密碼子偏好性合成了一個來源于Cronobacter universalis的新型植酸酶基因CuPhyS，成功地在畢赤酵母中實現了分泌和表達，并對表達產物的酶學特性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌（E.coli）DH5a為本研究室保存；巴斯德畢赤酵母菌株GS115（His－，Mut＋）購自Invitrogen公司；表達載體pYPX88（基因登錄號AY178045）由本研究室構建。

1.1.2 酶和試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、Protein marker均購自Takara公司；脫糖基化酶Endoglycosidase H購自Biolab公司；植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）購自Sigma；胃蛋白酶和胰蛋白酶以及其他試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養基

2018第十六次全國中西醫結合學會耳鼻咽喉科學術年會暨中國中西醫結合耳鼻咽喉科雜志第七屆第二次編委會議紀要（高娜 錢曉青 何子彧 韓朝）5∶插頁

LB培養基參見分子克隆［4］，YPD、BMGY、BMMY培養基均根據Invitrogen公司操作手冊配置。

1.2 方法

1.2.1 酵母表達載體構建

根據編碼C.universalis植酸酶成熟蛋白的基因序列，按照畢赤酵母密碼子的偏愛性，在不改變其氨基酸序列的前提下進行序列改造，并使GC含量保持適中。利用PCR方法［5］成功地將來源于C.universalis的新型植酸酶基因（登錄號：CAKX01000221.1）的序列合成。將優化的基因連接到畢赤酵母表達載體pYPX88上，篩選挑出陽性克隆子，得到畢赤酵母植酸酶表達載體pYPX88-CuPhyS。

1.2.2 酵母的電擊轉化

用5 mL YPD液體培養基培養畢赤酵母GS115菌，30℃培養過夜。取過夜培養菌液1 mL接種于100 m L新鮮的YPD液體培養基，30℃培養至OD600＝1.6—1.8，然后根據Invitrogen手冊的方法制備畢赤酵母感受態細胞，將重組質粒pYPX88-CuPhyS線性化后的DNA電擊轉入畢赤酵母感受態細胞（電壓175 kV，電阻400Ω，時間9.00ms）。轉化液冰置培養5min，取100μL涂布于SD-his固體平板上，30℃培養72 h至轉化子長出。

1.2.3 重組酵母的誘導表達

將活性較強的菌液接種于100 mL BMGY（含1%甘油）中，28℃劇烈震蕩培養至OD600值約5.0，離心收集菌體，加入20 mL誘導培養基BMMY（含1%甲醇）懸浮菌體，繼續28℃誘導培養，每隔24 h添加一次甲醇。每隔6 h取樣檢測各菌株上清液的植酸酶活性，從中篩選出表達植酸酶的轉化子。

根據酶活檢測方法［6］，植酸酶酶活單位（U）定義為：在37℃和pH 5.5的條件下，1 min內從5.0 mmol/L的植酸鈉溶液中水解釋放出1μmol無機磷所需的酶量為1個酶活單位。

1.2.4 表達產物的SDS-PAGE分析及脫糖基化處理

取上清酶液1.5 mL流過用緩沖液A（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol/L咪唑和300 mmol/L NaCl）平衡好的鎳柱（Ni2＋-NTA agarose affinity column），然后用洗滌液B（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，20 mmol/L咪唑和300 mmol/L NaCl）洗滌，最后用洗脫液C（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，250 mmol/L咪唑和300mmol/LNaCl）洗脫。其表達產物取8μL進行SDS-PAGE分析。同時取9μL上清液進行脫糖基化處理，建立如下反應體系：9μL上清液加1μL 10×Glycoprotein變性緩沖液，100℃煮沸10 min后使其變性，加1.0μL 10×G5緩沖液、1μL Endo H，37℃條件下反應1 h。

1.2.5 表達植酸酶酶學性質的測定

（1）最適pH和pH穩定性的測定：用不同pH緩沖液調節底物pH。酶液在37℃與不同pH的底物反應30 min后，相對活性最高所對應的pH為最適pH。pH穩定性是在不同pH的緩沖液條件下，37℃處理24 h，然后在最適條件下（最適pH，37℃，反應30 min）測定酶活。（2）最適溫度和熱穩定性的測定：最適溫度是用0.2 mol/L NaAc-HAc（pH 4.0）稀釋好的植酸酶液與底物0.75 mmol/L植酸鈉在不同的溫度下反應30 min后測定相應的酶活性。對于溫度穩定性，是將稀釋好的酶液分別在50℃、60℃和70℃水浴分別加熱不同時間后立即冰置冷卻，在37℃，pH 4.0條件下反應30 min測定酶活。（3）不同金屬離子對植酸酶的影響：在含0.75 mmol/L植酸鈉底物的NaAc-HAc緩沖液（pH 4.0）中分別加入不同金屬離子、巰基化合物、變性劑和金屬螯合劑，在37℃，pH 4.0反應30 min，以未加入金屬離子和其他化學試劑的緩沖液做空白對照。（4）胃蛋白酶和胰蛋白酶對植酸酶影響的測定：用相應的0.2 mol/L Gly-HCl（pH 2.0）和0.2 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）分別稀釋好的胃蛋白酶和胰蛋白酶液與植酸酶按一定重量比例（蛋白酶/植酸酶w/w：1/500、1/250、1/100、1/1、100/1、250/1、500/1、1 000/1）混合，37℃下分別處理4 h，然后在pH 4.0條件下反應30 min再測定酶活性，以未處理的初酶活性作對照。

2 結果與分析

2.1 CuPhyS基因的合成和含CuPhyS基因重組表達載體的構建

綜合影響基因表達的各種因素，在不改變氨基酸序列的前提下對植酸酶基因進行改造，共改變了266個堿基，G＋C含量由原來的46.8%提高到50.6%，基本符合畢赤酵母G＋C的含量特征。

經過改造的CuPhyS基因通過Xho I和Sac I位點定向插入酵母表達載體pYPX88，與其中的α-因子信號肽編碼序列的3’端融合，得到重組表達載體pYPX88-CuPhyS（圖1），通過酶切鑒定證實該重組質粒構建正確。BLAST比對結果顯示：CuPhyS基因和野生型基因有80%的同源性（圖2）。

圖1 重組表達質粒pYPX88-CuPhyS圖譜Fig.1 Themap of recombinant expression plasm id pYPX88-CuPhyS

圖2 合成基因CuPhyS序列與野生型序列的同源性比對Fig.2 Sequence hom ology alignm ent between synthetic and w ild genes

2.2 重組植酸酶基因在畢赤酵母中的表達

SDS-PAGE分析結果表明（圖3），畢赤酵母表達的植酸酶其表觀分子量在49—58 kD，比從氨基酸序列推斷出的理論分子量（約46.5 kD）大，證明植酸酶基因不僅能有效分泌表達，而且表達產物還能進行蛋白質翻譯后的修飾-糖基化。另外，培養液中除了植酸酶蛋白外，其他蛋白質幾乎不可見。將表達外源蛋白進行脫糖基處理后，分子量約為45 kD，與生物信息學預測理論分子量相當。

2.3 重組植酸酶CuPhyS的酶學性質分析

表達的植酸酶各種酶學性質測定結果表明：（1）其最適pH為4.0，更偏酸性。在pH 3.5—5.0，植酸酶的相對活性均在70%以上。在pH 3.5—4.5，植酸酶的相對活性穩定在90%以上（圖4-A）。因為動物胃里的pH為2.5，小腸pH為4.0—5.5，所以該重組植酸酶很適合動物食用，在胃和小腸中均能發揮較高活性。另外，該植酸酶在pH 10—13.0均有活性，但當pH小于1.0或大于13.0時，酶活力迅速下降（圖4-B）。（2）不同溫度下酶活性的測定結果表明，該酶的最適溫度為50℃，在30—65℃，植酸酶的相對活性在50%以上（圖5-A）。60℃條件下處理10 min后，CuPhyS的剩余活性為20%；而70℃條件下處理2 min后CuPhyS的剩余活性僅為20%，處理10 min后，該酶的剩余活性幾乎為0，說明該酶耐熱性較差（圖5-B）。（3）植酸酶活性的發揮受到很多金屬離子及化學試劑的影響。在酶促反應體系中加入不同的金屬離子和化學試劑，分別測定酶活性，結果表明，金屬離子K＋、Na＋、Cr2＋、Ni2＋、Li＋、Ca2＋、NH4＋、Mg2＋、Ba2＋、Co2＋、Mn2＋、巰基化合物DTT及金屬螯合劑EDTA對CuPhyS有一定的激活作用，其中Ca2＋、NH4＋、Ba2＋、DTT及EDTA對CuPhyS的激活作用比較明顯；Pb2＋、Zn2＋、Cu2＋、Al3＋和變性劑SDS對CuPhyS的酶促反應均有不同的抑制作用，Cu2＋和Zn2＋的抑制力較強，當反應體系中加入變性劑SDS時，酶已基本失去活性（圖6）。（4）胃蛋白酶和胰蛋白酶對該酶的影響結果如圖7所示：用胃蛋白酶處理植酸酶CuPhyS，30 min后酶活性剩余20%，用胃蛋白酶處理90 min后，酶活性基本喪失。由于胃蛋白酶處理是在酸性條件下進行的，可能是酸性環境對酶活性的影響與蛋白酶共同作用的結果。胰蛋白酶對CuPhyS的活性幾乎無影響，用胰蛋白酶處理180 min后酶活性為60%，說明植酸酶CuPhyS具有抗胰蛋白酶水解的能力。

圖3 表達植酸酶脫糖基前后的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of expressed phytase before and after deglycosy lated

圖4 重組植酸酶CuPhyS的最適pH（A）和pH穩定性（B）Fig.4 The optimum pH（A）and pH stability（B）of recom binase CuPhyS

圖5 重組植酸酶CuPhyS的最適溫度（A）和熱穩定性（B）Fig.5 The optimum tem perature（A）and thermal stability（B）of recombinase CuPhyS

圖6 各種金屬離子和化學試劑對CuPhyS活性的影響Fig.6 Effects of variousm etal ions and chem icals on activity of CuPhyS

圖7 胰蛋白酶和胃蛋白酶處理對CuPhyS活性的影響Fig.7 Effects of trypsin and pepsin treatments on activity of CuPhyS

3 結論與討論

按照表達宿主的密碼子偏愛性對優化外源基因的密碼子進行改造，是提高外源基因表達量的一種有效方法［7-8］。畢赤酵母密碼子使用偏愛性尤為明顯，如Pro的密碼子CCG、Gly的密碼子GGG、Ala的密碼子GCG等在畢赤酵母高表達基因中的使用頻率為零，當外源基因中含有這些密碼子時將嚴重制約其在畢赤酵母中的表達。本研究將CuPhyS基因中所有低偏愛性密碼子及大部分中等偏愛性密碼子替換為高偏愛性密碼子，使其在畢赤酵母表達系統實現了高效表達。本研究已經獲得一個來源于C.universalis并且成功表達在畢赤酵母的新型植酸酶蛋白，將該酶應用于大規模的工業生產將會極大程度地降低生產成本。

畢赤酵母表達系統會使外源蛋白進行糖基化。如大多數真菌表達的植酸酶都會有不同程度的糖基化，糖基化便利了蛋白空間結構的折疊，從而增加了蛋白的穩定性［9］。對于植酸酶，糖基化主要是增加了其對溫度的穩定性，而對最適pH和最適溫度則沒有影響［10］。脫糖基化處理結果表明，該酶蛋白為糖蛋白，不同程度的糖基化造成了其分子量的差異。而本研究中該分子量有差異的重組蛋白CuPhyS在酶學性質上幾乎沒有差異。

植酸酶活性的發揮受到很多金屬離子的影響。Zn2＋和Cu2＋等多價離子可和酶底物植酸發生絡合作用，形成難溶的復合物，降低了植酸的有效濃度，從而降低酶的活性。Mg2＋能催化植酸的水解，當它存在時植酸酶的活性得以提高。本試驗還證明了Ca2＋、Mn2＋和EDTA也能激活植酸酶的活性。

目前，植酸酶在飼料應用中主要存在三個方面的問題，其中主要問題是植酸酶的pH適用范圍、植酸酶的熱不穩定性以及對胃、胰蛋白酶的耐受性［11］。本試驗通過酶學性質的比較分析表明，來源于C.universalis的植酸酶具有較高的耐熱性，很好地解決了飼料生產過程中因高溫制粒而造成的植酸酶活性損失較多的問題；其次，該酶還具有廣泛的pH耐受性，pH 1.5—6.5都能保持40%以上的酶活，說明該酶在動物消化道內的適應性較強。對重組植酸酶的抗蛋白酶能力的研究發現其具有一定的抗胰蛋白酶的能力，但抗胃蛋白能力較弱。與報道的非重組酶抗蛋白酶性質［12］不同，其原因正在進一步研究。如何使植酸酶具有高溫耐受性并且能在動物正常體溫和腸胃pH條件下發揮最大活力，將是生產植酸酶制劑需要解決的重要問題。另外，隨著植酸酶應用范圍的擴展，目前在食品加工、肌醇和肌醇單磷酸鹽料添加劑生產等方面植酸酶也有應用，根據本研究植酸酶的優缺點，期望在不同的領域開發應用。

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（責任編輯：程智強）

The enzymological property of phytase from Cronobacter universalis

FU Xiao-yan，HAN Hong-juan，ZHU Bo，WANG Bo，PENG Ri-he ，YAO Quan-hong
（Biotechnology Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China）

According to the selection bias of Pichia pastoris toward a codon，a novel phytase gene（CuPhyS）from Cronobacter universalis was synthesized via codon optimization and successfully expressed as exocrine protein in P.pastoris GS115，and the protein secretion yield of CuPhyS could accumulate to approximately 45μg/mL.The research of the enzymological property showed that the optimal conditions for the phytase were pH 4.0 and 50℃，and itwas comparatively stable within pH 3.0—12.0 and had a good thermal stability at50℃.To a certain extent the enzyme activity was activated by Mg2＋and inhibited by Cu2＋.The phytase also had a good ability to resist hydrolyzation by trypsin and partial hydrolyzation by pepsin.

Phytase；Cronobacter universalis；Pichia pastoris；Enzymological property

S816.3

：A

1000-3924（2017）02-001-06

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.01

2016-02-22

付曉燕（1979—），女，碩士，助理研究員，研究方向：植物微生物基因工程。Tel：13564368816，E-mail：fuxiaoyan0211＠163.com

，彭日荷E-mail：pengrihe69＠yahoo.com；姚泉洪E-mail：yaoquanhong65＠yahoo.com