人工合成高效啟動子用于基因治療及疫苗研制

劉成倩，李 紅，易建中，孫曉云，2

（1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

人工合成高效啟動子用于基因治療及疫苗研制

劉成倩1，李 紅1，易建中1，孫曉云1，2

（1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

為了制備可用于基因治療載體構建及疫苗研制的啟動子，根據高效啟動子的特點，人工合成了一段特異啟動子（SEP）序列，通過酶切連接將其插入到含有綠色熒光蛋白的pEGFP-C1載體內，得到一新的啟動子ESP，借助轉染試劑LipofectamineTM2000將其和pEGFP-C1質粒轉入BHK21細胞，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況。結果顯示：含有啟動子ESP序列的pEGFP-ESP-C1熒光蛋白表達量明顯高于pEGFP-C1，而且表達穩定。結果提示啟動子ESP可以用于基因治療載體的構建，將導入的基因在細胞內的表達水平提高，為基因治療的最后成功打下基礎。

啟動子；基因治療；疫苗研制

基因治療是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，達到治療目的的方法。它是伴隨著DNA重組技術的成熟而發展起來的，可以治療多種疾病，被譽為治療疾病的一種新手段。美國是最早嘗試進行基因治療的國家，隨著1990年美國第一個臨床試驗治療方案的批準，其他國家也開始了基因治療的研究。在這些治療方案中，惡性腫瘤治療方案居多，還有心血管疾病、感染性疾病、神經性疾病等。但是在眾多治療方案實施后發現有肯定療效者很少［1-2］，專家們提出，現在是基因治療回到基礎研究上來的時候了。

基因治療領域目前存在的主要問題是安全性和有效性。比如基因導入系統缺乏靶向性，這是基因治療有待解決的核心問題；還有導入基因的表達量太低，治療效果大打折扣，如果能將導入基因的表達量提高一倍甚至更多，則治療效果會大大提高［3-4］。自1995年以來，基因治療領域的學者們在改善基因導入系統和載體方面做了很多的努力，新的技術和方法層出不窮［5］。目前在基因導入載體方面研究應用較多的是病毒載體，然而基因治療成功的關鍵是載體攜帶目的基因的靶向高效表達［6］。隨著內含子、增強子、特異的啟動子等的發現，將會掀起基因治療新的熱潮。

本研究根據高效啟動子的機構特點，設計了一段特異啟動子（SEP）序列，通過細胞轉染試驗發現新的啟動子可以啟動外源基因的高效表達，而且表達穩定。此啟動子可以用于基因治療載體的構建，將導入的基因在細胞內的表達水平提高，為基因治療的最后成功打下基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種及試劑

大腸埃希氏菌（E.coli）種TOP10、BHK21細胞和含有綠色熒光蛋白的pEGFP-C1質粒，均由上海市農業科學院畜牧所病毒課題組提供。小量質粒抽提試劑盒購自上海嘉儀生物有限公司，轉染試劑LipofectamineTM2000購自上海碩盟生物科技有限公司。

1.2 特異啟動子SEP的合成

根據高效啟動子的結構特點，設計了一對互補序列。標記為SEP-F/R，5’和3’端均引入了酶切位點Nhe I。序列送往上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 增強啟動子ESP的構建

將合成好的SEP-F/R，各加入20μL ddH2O，用DNA寡核苷酸退火緩沖液進行退火處理。

經上述處理的SEP-F/R產物與pEGFP-C1質粒分別用內切酶Nhe I酶切，回收酶切后的目的片段，用T4連接酶連接過夜。連接產物轉化E.coli TOP10，篩選出的陽性克隆送北京六合華大基因上海分公司測序。通過測序驗證將插入序列正確的克隆命名為pEGFP-ESP-C1。

1.4 細胞轉染試驗

取出一瓶生長狀態良好的BHK21細胞，傳至24孔板中，轉染前確保每個孔內貼壁細胞長至90%—95%。將質粒及轉染試劑LipofectamineTM2000按比例稀釋。質粒pEGFP-C1和pEGFP-ESP-C1分別轉染0.25μg/孔，每個質粒樣品設3個復孔。24 h后在熒光顯微鏡下觀察表達情況，并拍照。

1.5 綠色熒光蛋白GFP基因檢測

將轉染24 h的細胞取出，棄掉上清液，用PBS洗3次，加入100μL細胞裂解液裂解細胞。取出75μL用ModulusTM單管型多功能檢測儀檢測GFP熒光值。

1.6 W estern-blot分析

將1.5中的細胞裂解液跑SDS-PAGE電泳，按半干轉移法轉PVDF膜，以抗GST標簽鼠單克隆抗體為一抗孵育1.5 h，用PBST洗3次，每次5 min。再用HRP標記的山羊抗小鼠IgG為二抗孵育1.5 h，用PBST洗3次，每次5 min，再用PBS洗1次。最后在暗室內曝光顯影。

2 結果與分析

2.1 pEGFP-ESP-C1菌落PCR篩選結果

SEP基因PCR產物與pEGFP-C1酶切連接后，挑取2個單菌落進行菌落PCR篩選，菌落PCR篩選結果見圖1。

2.2 pEGFP-ESP-C1測序結果

通過該序列結果可以看出，人工合成的特異啟動子SEP已經成功插入到質粒pEGFP-C1 CMV啟動子下游，得到一段689 bp新的增強啟動子ESP，命名為pEGFP-ESP-C1。其序列如下：

2.3 熒光顯微鏡觀察結果

熒光顯微鏡下觀察可以發現：含有ESP啟動子的綠色熒光較多，熒光蛋白表達量明顯高于只含CMV啟動子的pEGFP-C1（圖2和3）。

圖2 質粒pEGFP-C1轉染細胞熒光顯微鏡結果Fig.2 The fluorescencem icroscope observation of p lasm id pEGFP-C1 transfection cell

圖3 質粒pEGFP-ESP-C1轉染細胞熒光顯微鏡結果Fig.3 The fluorescencem icroscope observation of p lasm id pEGFP-ESP-C1 transfection cell

2.4 綠色熒光蛋白GFP基因檢測

pEGFP-C1和pEGFP-ESP-C1轉染后表達細胞裂解液用Modulus TM單管型多功能檢測儀檢測的GFP熒光值分別為7 108.05和26 908.44。說明含有ESP啟動子的pEGFP-ESP-C1熒光值明顯高于pEGFP-C1的熒光值，該結果和在熒光顯微鏡下觀察的結果明顯一致。

2.5 W estern-blot分析結果

裂解后的細胞經SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜后，能與GST標簽單克隆抗體發生特異性反應，且GST蛋白表達量與2.3和2.4的結果一致（圖4）。

圖4 W estern-blot分析結果Fig.4 W estern-blot analysis results

3 討論

基因治療涉及靶基因、靶基因載體和靶基因的表達調控，其中靶基因載體的選擇是基因治療的關鍵之一［7］。目前，病毒載體主要用于基因治療，同樣對于疫苗的研制，表達載體的選擇也至關重要，特別是遇到一些基因不易于表達而且純化困難，直接導致疫苗的生產成本高［8-10］。相比于載體系統的選擇，治療基因或者目的基因的表達調控的研究較為滯后，所以新的方法能使外源基因的表達水平提高，不僅對基因治療有影響，而且對疫苗的研制也會帶來新突破。

本研究設計和合成的特異啟動子，屬于首創。通過一系列試驗也證明了該啟動子可以啟動外源基因的高效表達，而且表達穩定。此研究成果對基因治療領域及疫苗研制方面都起到一定的推動作用。

［1］GURA T H.After a setback，gene therapy progresses gingerly［J］.Science，2001，291（5509）：1692-1697.

［2］WANG G，DONG X Y，TIANW H，et al.Evaluation ofmiR-122-regulated suicide gene therapy for hepatocellular carcinoma in an orthotopic mousemodel［J］.Chinese Journal of Cancer Research，2013，25（6）：646-655.

［3］鄧洪新，田聆，魏子全.基因治療的發展現狀、問題和展望［J］.生命科學，2005，17（3）：196-199.

［4］林清凡，傅增順.基因治療的發展現狀與展望［J］.醫藥前沿，2012，2（3）：133-134.

［5］MAJHEN D，AMBRIOVIC-RISTOV A.Adenoviral vectors—How to use them in cancer gene therapy？［J］.Virus Res，2006，119（2）：121-133.

［6］王振發，王列，衛立新.基因治療病毒載體的研究進展［J］.醫學綜述，2007，13（7）：490-492.

［7］曹明媚，戚中田.基因治療載體的研究進展［J］.國外醫學（腫瘤學分冊），2004，31（1）：22-26.

［8］劉成倩，王靜，李紅，等.雞干擾素-α基因原核表達載體的構建及高效表達［J］.中國畜牧獸醫，2014，41（4）：47-50.

［9］賀靈芝，曾慶友，許瑞安.基因治療中高分子載體的發展現狀［J］.高分子通報，2010（10）：46-52.

［10］LIAN M，WANG Q，FANG J，et al.Antagonism between gene therapy and epigenetic therapy on human laryngeal carcinoma tumor-bearingmice［J］.Chinese Medical Journal，2013，126（2）：248-253.

（責任編輯：張睿）

Preparation of artificial synthetic promoter for gene therapy and vaccine development

LIU Cheng-qian1，LIHong1，YIJian-zhong1，SUN Xiao-yun1，2
（1Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；2College of Fisheries and Life Science，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China）

A promoter was constructed by this experiment，which could be used for the construction of gene therapy vector and vaccine development.According to the characteristics of the promoter，a sequence of specific promoter（SEP）was synthesized，which was inserted into pEGFP-C1 containing green fluorescent protein.The pEGFP-C1 plasmid containing a new promoter ESP was transfected into BHK-21 cells，the green fluorescent protein expression was observed by using a fluorescence microscopy.The results showed that the protein expression of pEGFP-ESP-C1 was significantly higher than that of pEGFP-C1，and the expression was stability.The results indicated that the promoter ESP could be used in the construction of gene therapy vector，and the expression level of the gene transferred into the cellwas improved，which laid the foundation for the final success of gene therapy.

Promoter；Gene therapy；Vaccine development

S852.65；R392

：A

1000-3924（2017）02-085-04

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.16

2016-06-06

上海市科學技術委員會重點科技攻關項目（12391901900）

劉成倩（1984—），女，碩士，助理研究員，主要從事動物疾病的分子生物學及免疫學研究。E-mail：liuchengqian306＠sohu.com

，E-mail：lihong20061029＠163.com