豬圓環病毒2型熒光定量PCR檢測試劑盒的研制及應用

任方方，胡瑞麗，倪建平，許 燕，李春華，趙 笑，杜亞楠，趙 凱

（1上海市農業科學院生物技術研究所，上海 201106；2上海師范大學，上海 201306；3上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106；4寧夏大學，銀川 750021；5上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海 201106）

豬圓環病毒2型熒光定量PCR檢測試劑盒的研制及應用

任方方1，2，胡瑞麗1，2，倪建平3，許 燕2，李春華3，趙 笑4，杜亞楠2，趙 凱1，5

（1上海市農業科學院生物技術研究所，上海 201106；2上海師范大學，上海 201306；3上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106；4寧夏大學，銀川 750021；5上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海 201106）

為了開發針對豬圓環病毒2型（PCV2）的診斷技術及其試劑盒，對PCV2的ORF2基因設計相應的特異性引物和探針，采用熒光定量PCR方法檢測PCV2。試驗表明：該方法循環閾值（Ct）與標準DNA模板在101—107拷貝/μL濃度范圍內具有極好的線性關系，相關系數為0.9999；重復性好，批內試驗中Ct值的變異系數在0.59%—1.05%，批間試驗的Ct值變異系數為1.9%—4.2%；研制的檢測試劑盒與豬瘟病毒（HCV）、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）不發生交叉反應，檢測極限和定量極限分別為10和100拷貝數。用此方法對1 000個臨床樣品進行檢測，結果710個被檢測為陽性。結果顯示，所研制的PCV2診斷試劑盒靈敏度高，特異性強，穩定性好，為PCV2的檢測和流行病學的調查提供了一種簡便快速的診斷方法。

豬圓環病毒2型；熒光定量；PCR檢測；診斷試劑盒

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環病毒科圓環病毒屬，1974年最先由德國科學家發現，但在當時并未引起足夠的重視。直到1991年，在加拿大豬群中，出現了一種被稱為斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥的疾病，這種疾病給當地養豬產業帶來了巨大的經濟損失，才引起人們的關注。根據其抗原性，PCV可分為PCVl（Porcine circovirus type 1）和PCV2（Porcine circovirus type 2）兩種類型。感染試驗表明：PCVl不會對豬造成危害，但PCV2對豬具有一定的致病性，它與斷奶后仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、增生性壞死性肺炎（PNP）、豬呼吸道與繁殖綜合癥（PRRSV）、先天性顫抖、豬傳染性胃腸炎（TGE）等臨床癥狀相關，更為重要的是它會引起對免疫功能的抑制，并容易導致其他的病原微生物繼發或并發感染。該疾病已在美國、法國、意大利、西班牙、德國、荷蘭、丹麥等多個國家和地區廣泛流行，給世界的養豬業帶來了巨大的經濟損失［1-5］。因此，豬圓環病毒2型引起了國內外學者的廣泛關注。由于PCV2嚴重地破壞了豬的免疫系統，致使豬全身的淋巴系統出現病變并造成了免疫功能低下以及抵抗力極弱，因此一旦豬的體內存在其他的病毒或者原蟲、細菌性感染，就會暴發性流行，并造成巨大的經濟損失［6］；PCV2感染在中國的某些區域非常普遍［7］，而且由于免疫系統受到了嚴重的破壞，導致各種疫苗接種應答效果差，免疫失敗，并且誘發其他疾病暴發。因此，迄今國內外尚無疫苗可進行免疫，并且也沒有理想的化學藥物對其進行有效防治。鑒于這種現狀，PCV2感染的早期診斷和病豬的淘汰成為PMWS防治的重點。目前，對PCV2的分子診斷主要是依靠分子生物學檢測技術和免疫學檢測技術。但是由于免疫學技術自身的敏感性和特異性都較差，因此分子生物學檢測技術在PCV2分子診斷上得到了迅速的發展，與普通PCR和ELISA相比，定量PCR是一種更有效、特異、快速的定量方法，并可以同時減少假陽性和污染。因此，定量PCR開始被廣泛應用，并且成為主要的病原體檢測方法［8］。另外，本研究的創新點和先進性在于不僅成功建立了Taqman實時熒光定量PCR方法，還將這種方法研制成試劑盒進行推廣應用，這在該領域是比較少見的。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）病毒PCV2毒株BJ0804和豬瘟病毒（HCV）、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV），由上海市農業科學院畜牧所提供。（2）其他材料：血液組織細胞基因組提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；定性PCR用的dNTPs、Taq DNA聚合酶及其緩沖液、定量PCR用的dNTPs、Taq DNA聚合酶及其緩沖液，購自Takara寶生物工程（大連）有限公司；定量PCR引物、TaqMan探針，由Invitrogen生物有限公司合成；其余常規試劑（分析純）均來自于上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 引物和探針

GenBank序列號為EU921257.1的PCV2毒株BJ0804，以其開放閱讀框為模板設計引物和探針（表1）。引物和探針設計使用軟件Primer Premier 5.0，Oligo DNAman 4.0和Primer Analysis。PCR產物長度為149 bp。

表1 PCV2引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probe of PCV2

1.3 熒光定量PCR擴增產物重組質粒

以豬圓環病毒2型BJ0804株為標準模板，F3和B3為上下游引物，按照PCR體系進行擴增，PCR反應體系為25μL體積包含：ddH2O 16.5μL，10×PCR buffer2.5μL，dNTP 2.0μL，F3 1.0μL，B3 1.0μL，Taq ploymerase（Takara Corp.）1.0μL，1.0μL提取的DNA。反應程序：95℃預變性5 min，進入PCR反應循環：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35個循環，最后72℃總延伸5min。設立陰性對照，進行常規PCR。反應結束后，取5μL PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得149 bp的擴增產物。

PCR產物的回收與純化按照Omega公司E.Z.N.A.GelExtraction Kit說明書進行。回收產物與載體連接反應參照pMD18-T vector的使用說明進行。連接產物轉化感受態細胞。采用菌落PCR法篩選陽性重組質粒。

1.4 標準品濃度的計算

參照3SSpin Plasmid Miniprep Kit V3.1的說明書小量制備質粒，將上述質粒做100倍稀釋后，用紫外分光光度計測定其濃度，然后按照下面的公式轉換成質粒的拷貝數：拷貝數＝質粒濃度×阿氏常數/（一個堿基對的平均分子量×質粒的總長度），標準品作10倍梯度稀釋。用紫外分光光度計測定陽性質粒的OD值，計算其濃度，并依次稀釋成含質粒數量分別為108、107、…、101、100個拷貝共9個樣品梯度作為標準品，－40℃保存備用。

1.5 實時熒光定量PCR檢測方法的建立

操作方法：（1）試劑準備間：此房間放置PCR體系配制原料如Buffer、引物、探針、雙蒸水等等，不可放置陽性參照等PCR反應模板，配制相應的PCR反應體系，陰性對照如果加入的是水可在該實驗室加入，并蓋嚴管蓋；具體操作：1.5 mL離心管中加入除模板外的其余物質，渦旋混勻，瞬離，然后將混合物分裝在熒光定量PCR管中，每管20μL。與之對照的組里每個管里加5μL的ddH2O。（2）樣本處理間：此房間放置PCR反應模板，不可放置PCR體系配制原料，將在第一間配好的PCR體系在該實驗室中加入模板，模板要從低拷貝到高拷貝順序加入，加好一個立即蓋嚴管蓋。（3）擴增間：配好的PCR反應液放置PCR儀中進行擴增，確保進入該實驗室前，所有管蓋必須已經蓋嚴，擴增完成的PCR管蓋不可在此間打開；具體操作：將管子放進儀器里，進行反應。

PCR程序：94℃10 min；94℃30 s，54℃30 s，72℃31 s，45個循環。

25μL的反應終體系含有2.5μmol/L dNTP 2.5μL、10×PCR buffer2.5μL、Probe溶液0.4μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，DNA模板5.0μL，滅菌雙蒸水補足。MgSO4按3.0μL、4.0μL、5.0μL、6.0μL優化，Primer-1，Primer-2按0.6μL、0.7μL、0.8μL、0.9μL、1.0μL進行優化，具體優化組合參見表2。

表2 體系優化Table 2 Optim ization of system

保持25μL的反應體系中2.5μmol/L dNTP、10×PCR buffer、Taq DNA聚合酶0.3μL、DNA模板5.0μL量不變，按照上面試驗組合，逐一驗證Probe溶液0.4μL、0.5μL、0.6μL試驗效果。

所有的定量PCR中每個反應進行3次，每次每個樣品含有3個重復。定量PCR反應條件為：94℃預變性10 min，進入PCR反應循環：94℃變性30 s，54℃退火30 s和72℃延伸31 s，共進行45個循環。最后在延伸階段，收集熒光信號。

通過這樣對體系中的條件逐一優化，選出最佳比例組合，完成優化過程，建立實時熒光定量PCR檢測方法。

1.6 標準曲線的建立

將已知拷貝數的質粒做10倍系列稀釋作為模板，進行熒光定量PCR擴增，得到相應的動力學曲線，并計算產生相應的標準曲線。

1.7 PCV2熒光定量PCR定量檢測試劑盒的組裝和說明書

豬圓環病毒2型熒光定量PCR檢測試劑盒包裝規格：200次，試劑盒組成如下：

運輸及保存方法：低溫運輸，長期保存置于－80℃；產品融化后于4℃保存，并在6個月內用完。

產品介紹：使用本試劑盒快速簡便，可對豬圓環病毒2型進行實時PCR的檢測。

注意事項：（1）減少試劑分注、攪拌次數，保證正確的試劑分注，有效降低試驗結果間的誤差。（2）在移液操作前，要將試劑輕輕離心至容器底部。Taq DNA Polymerase粘度較高，在取液時一定要緩慢操作試劑，在混勻時要緩慢進行，避免產生氣泡。（3）反應液的配制、分裝一定用新的（無污染的）吸頭、Microtube等，盡量避免污染。（4）為了確定試劑的有效性，應該同時做一管含有標準分子的陽性對照質控反應。（5）所有接觸病料的物品均應合理處理，以免污染實驗室。（6）把全部的試驗分區域進行操作，嚴禁器材和試劑倒流。（7）顯色劑低毒，應于室溫條件避光保存，操作時應戴上手套。（8）不要讓試劑盒中的各個成分受到污染。（9）嚴格遵守操作說明可以獲得最好的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

操作步驟：（1）在無菌潔凈的PCR管中，參考下面體系配制反應溶液：

（2）輕輕混勻后短暫離心，每個樣品做3個重復。同時用標準分子101拷貝/μL、102拷貝/μL、103拷貝/μL、104拷貝/μL、105拷貝/μL PCV2質粒做標準曲線。置于PCR儀中啟動反應程序，反應程序見下：94℃預變性10 min，進入PCR反應循環：94℃變性30 s，54℃退火30 s和72℃延伸31 s，共進行45或50個循環。在延伸階段收集熒光信號。

結果分析與判斷：（1）質控標準：陰性樣品無Ct值或無擴增曲線；陽性樣品對照Ct值應小于30.0，并出現典型擴增曲線；否則，此次試驗視為無效。（2）結果描述與判斷：陰性樣品無Ct值或無擴增曲線，表示樣品中無豬圓環病毒2型；陽性樣品Ct值小于或等于30.0，且出現典型擴增曲線，表示樣品中有豬圓環病毒2型；有效原則Ct值大于30.0的樣品建議重做；重做結果無數值者為陰性，否則為陽性。

1.8 PCV2的熒光定量PCR檢測試劑盒特異性試驗

用該檢測試劑盒對PCV2質粒、PCV2病毒樣品、豬瘟病毒（HCV）、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）的cDNA為模板和雙蒸水進行熒光定量PCR檢測，測定該檢測試劑盒的特異性。

1.9 PCV2的熒光定量PCR檢測試劑盒靈敏度試驗

將上述重組質粒做梯度稀釋，并用相應的引物探針進行Real-time PCR擴增，測試該檢測試劑盒的靈敏度。

1.10 PCV2的熒光定量PCR檢測試劑盒重復性試驗

調水總干渠工程引水隧洞最大埋深1 100 m，埋深大于600 m的隧洞長約10 km，埋深大于900 m隧洞長約2.7 km，屬深埋長隧洞，相應地應力很高。埋深130 m～600 m隧洞段最大水平應力約為6 MPa～20 MPa；埋深1 000 m左右的隧洞段最大水平應力近30 MPa。由于地應力的影響，在干燥和質地堅硬的巖層中可能發生巖爆，在軟巖地層中極易發生塑性變形。

將試劑盒里105拷貝/μL、103拷貝/μL、101拷貝/μL的質粒溶液，作為模板進行擴增，每個樣品設置10個重復，總共進行試驗10次，然后計算每次試驗同一濃度的各個樣品以及各次試驗中同一濃度的各個樣品的Ct值的變異系數，進而對試劑盒的重復性就行驗證。

1.11 臨床樣品檢測

把標準品以及臨床樣品，分別作為模板，然后在同次試驗中，進行熒光定量PCR反應，用研制的實時熒光定量PCR檢測試劑盒對1 000份臨床樣品進行檢測。

1.12 PCV2熒光定量PCR檢測試劑盒的應用

委托上海博滿生物科技有限公司、上海斯高勒生物科技有限公司、上海珺玨生物科技有限公司在上海市、江蘇省、浙江省的畜牧養殖場中進行推廣應用。

2 結果與分析

2.1 實時熒光定量PCR檢測方法的建立

優化結果顯示最佳比例組合為：（25μL的反應體系）ddH2O 6.5μL、2.5μmol/L dNTP 2.5μL、10×PC buffer 2.5μL、MgCl26μL、Primer-1 0.9μL、Primer-09μL、Probe 0.4μL、Taq DNA聚合酶0.3μL、DNA模板5.0μL。

利用最佳比例組合進行3次重復性試驗，結果見圖1。

2.2 標準曲線的建立

將已知拷貝數的質粒做10倍系列稀釋作為模板，進行熒光定量PCR擴增，建立標準曲線。標準曲線在101—107拷貝/μL濃度范圍內呈現極好的線性關系，相關系數為0.9999（圖2）。

2.3 PCV2熒光定量PCR檢測試劑盒

該試劑盒（圖3）含有PCV2質粒、引物、探針、Buffer、dNTPMix、MgCl2和Taq DNA Polymerase，該試劑盒靈敏度高、特異性強、重復性好，具有較好的市場推廣價值。

圖1 PCV2實時熒光定量PCR結果Fig.1 Real-time fluorescent quantitation PCR of PCV2

圖2 Ct值與PCV2質粒拷貝數對數之間的標準曲線Fig.2 Standard curve between Ct value and logarithm of PCV2 p lasm id copy number

圖3 PCV2熒光定量PCR檢測試劑盒Fig.3 Fluorescent quantitation PCR detection kit of PCV2

2.4 PCV2熒光定量PCR檢測試劑盒的特異性試驗

對供試的樣品進行實時熒光PCR檢測，引物Primer-1、Primer-2和探針在非PCV2病毒樣品中均未出現熒光信號增幅，而在所有供試PCV2病毒樣品中均有明顯的熒光增幅，說明引物和探針特異于PCV2病毒樣品檢測。PCV2熒光定量PCR檢測試劑盒特異性檢測結果見圖4。該方法能在3 h內報告樣品的檢測結果。

2.5 PCV2熒光定量PCR檢測試劑盒的靈敏度試驗

對PCV2質粒按拷貝數10倍梯度稀釋的6組樣品：101、102、103、104、105、106進行10倍梯度稀釋。6個10倍梯度稀釋樣品均有明顯熒光增幅，最低DNA濃度為10拷貝，即研制的PCV2實時熒光PCR檢測試劑盒檢測下限為10拷貝數，研制的PCV2實時熒光PCR檢測試劑盒定量極限為100拷貝數，符合日常檢測要求。PCV2熒光定量PCR檢測試劑盒靈敏度檢測結果見圖5—圖7。

2.6 PCV2的熒光定量PCR檢測試劑盒重復性試驗

批內試驗中Ct值變異系數：0.59%—1.05%，批間試驗的Ct值變異系數：1.9%—4.2%（表3）。

2.7 PCV2的熒光定量PCR檢測試劑盒的臨床樣品檢測

用該熒光定量檢測試劑盒檢測1 000個血清樣品，看是否感染PCV2。結果檢出其中有710個臨床樣品感染PCV2。

圖4 PCV2熒光定量PCR的特異性試驗Fig.4 Specific test for fluorescent quantitation PCR of PCV2

圖5 PCV2熒光定量PCR的靈敏度試驗（1）Fig.5 Sensitivity test for fluorescent quantitation PCR of PCV2（1）

圖6 PCV2熒光定量PCR的靈敏度試驗（2）Fig.6 Sensitivity test for fluorescent quantitation PCR of PCV2（2）

圖7 PCV2熒光定量PCR的靈敏度試驗（3）Fig.7 Sensitivity test for fluorescent quantitation PCR of PCV2（3）

表3 PCV2的熒光定量PCR檢測試劑盒批內試驗和批間試驗Table 3 Intra-and inter-lot tests for fluorescent quantitation PCR detection kit of PCV2

3 討論

調查顯示，歐洲部分國家、美國和加拿大100%的農場和受測樣品經血清分析為PCV2陽性［1，9］。對中國7個省和自治區采集的樣品經ELISA檢測，高達42.9%為PCV2陽性［10］。

據報道，由PCV2引起的疾病在農場中造成的死亡占豬死亡率的2%—3%到14%—30%［11］。因此，對PCV2的快速、特異的檢測和定量檢測對豬的PMWS的防控以及試驗研究都尤為重要。與普通PCR相比，Taqman PCR具有靈敏度高且污染少等優點。傳統PCR在進行凝膠分析時，可能會造成產物污染，從而導致后續試驗的假陽性等問題。因此實時熒光定量PCR已被廣泛應用在多個領域，同時也提高了檢測試驗的靈敏度，也更加節約了試驗所需的時間。

本研究首先對豬圓環病毒2型特異性基因組序列進行分析，通過多次的篩選得到了一個豬圓環病毒2型特異性基因所在的區域，即ORF2是PCV2的主要保守區域，可以作為檢測PCV2的參考區域，這段區域與PCV1具有很大的差異性［12］。雜交探針已被用于檢測PCV2，其檢測結果也具有較高的靈敏度和特異性。Brunborg等［12］用Taqman探針檢測到了ORF2中的一段84 bp的序列，從而對不同組織和血清樣品進行PCV2進行定量。Chung等［13］和Yang等［14］人分別用Taqman和SYBRGreen I對PCV2進行了定量。

針對其特異性序列，本試驗中設計不同的引物和探針，擴增了PCV2的149 bp的序列來檢測PCV2。對該試驗的重復性、靈敏度和特異性分別進行了鑒定，重復性試驗檢測結果顯示：本研究中所建立的檢測方法是穩定的、可靠的。也將其他病毒作為模板同時進行試驗，試驗結果顯示：本試驗所建立的方法具有很好的特異性，沒有與其他病毒發生交叉反應。試驗也對臨床樣品進行檢測，這樣評價了其作為特異性基因在豬圓環病毒2型實際樣品的Taqman熒光定量PCR檢測中的應用性。本試驗建立的方法和開發的試劑盒不僅可以提供一種快速的檢測PCV2的方法，也可能被應用于評價抗PCV2疫苗。本方法補充了PCV2檢測和定量方法。

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（責任編輯：程智強）

Development and application of fluorescent quantitation PCR detection kit of porcine circovirus type 2

REN Fang-fang1，2，HU Rui-li1，2，NIJian-ping3，XU Yan2，LIChun-hua3，ZHAO Xiao4，DU Ya-nan2，ZHAO Kai1，5
（1Biotech Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China；
2Shanghai Normal University，Shanghai201306，China；3Shanghai Jiamu Biological Products Company Limited，Shanghai201106，China；4Ningxia University，Yinchuan 750021，China；
5Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai201106，China）

In order to develop the diagnostic technique and diagnostic kit of porcine circovirus type 2（PCV2），specific primers and a probe for the PCV2 ORF2 gene were specially designed，and the PCV2 was detected by a fluorescentquantitation PCRmethod.The tests showed that the cycle threshold Ct and the standard DNA template had an excellent linear relationship between 101—107copies permicroliter，and their correlation coefficientwas 0.9999；The variation coefficient of Ct values was 0.59%—1.05%in the intra-lot test and 19%—4.2%in the inter-lot test，there being a good repeatability；The developed detection kit had no cross reaction with hog cholera virus（HCV），porcine respiratory and reproductive syndrome virus（PRRSV）and swine pseudorabies virus（PRV），and its detection and quantitation limitswere 10 and 100 copy numbers respectively.The detection of 1 000 clinical samples by thismethod showed that the 710 samples were positive.The result indicated that this kitwas high in sensitiveness，strong in specificity and good in stability，providing a simple and rapid method for PCV2 monitoring and epidemiological survey.

Porcine circovirus type 2；Fluorescent quantitation；PCR detection；Diagnostic kit

S852.65

：A

1000-3924（2017）02-089-07

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.17

2016-03-15

上海市閔行區重大產業化專項（2014MH076）

任方方（1987—），女，碩士，主要從事基因工程研究。Tel：021-62203047，E-mail：renfangfang668＠126.com

并列第一作者：胡瑞麗（1989—），女，碩士，研究方向：基因工程。Tel：021-62203047，E-mail：hrly524＠163.com

，E-mail：kzhao118＠163.com