雞傳染性支氣管炎病毒M基因真核表達載體的構建及免疫效力研究

孫曉云，劉成倩，易建中，李 紅

（1上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106）

雞傳染性支氣管炎病毒M基因真核表達載體的構建及免疫效力研究

孫曉云1，2，劉成倩2，易建中2，李 紅2

（1上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106）

從GenBank上下載雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）H120型標準株M基因的標準序列，以此標準序列為模板設計合成一對引物。從IBV尿囊液中提取總RNA，采用PCR技術擴增出M基因，將擴增出的目的片段克隆至pMD18-T載體上獲得pMD18-IBV-M質粒，通過亞克隆將目的基因連接到經過改造的pEGFP-C1-SCP-SEC載體上，成功構建真核表達質粒pC1-IBV-M。通過間接免疫熒光試驗驗證了構建的真核載體能在真核細胞內表達，通過動物免疫試驗來檢測該真核表達載體對動物的免疫保護情況。

雞傳染性支氣管炎病毒；M基因；動物試驗

雞傳染性支氣管炎（Chicken infectious bronchitis，IB）是一種急性呼吸道傳染病，通過接觸傳播，該病由雞傳染性支氣管炎病毒（Chicken infectious bronchitis virus，IBV）引起，屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬。病雞感染后主要表現為咳嗽、打噴嚏和氣管啰音，雛雞感染后出現伸頸，張口呼吸，流鼻涕，產蛋雞則表現產蛋減少、產粗殼蛋或軟殼蛋。腎型沒有呼吸道癥狀，主要表現腎炎綜合征、花斑腎和組織器官表面白色尿酸鹽沉積［1-2］。該病對各日齡雞均具有感染性，其中以1—4周齡的雛雞最易感，死亡率高達40%—90%［2-4］。該病在世界范圍內廣泛流行，對養禽業的危害非常大，是重大傳染病之一［2］。

IBV為單股正鏈RNA，有囊膜、不分節段，是目前所知的最大的RNA病毒，病毒粒子略呈球形，有時呈多形性［2］，主要由囊膜和核衣殼兩部分組成，囊膜內主要包含膜蛋白（M蛋白）和纖突蛋白（S蛋白）這兩種結構蛋白；核衣殼較長呈螺旋狀，主要包含核衣殼蛋白（N蛋白）［4-7］。在IBV病毒編碼的三種結構蛋白中，M蛋白約占病毒結構蛋白總量的40%，其基因在進化中很少發生變異，具有較高的保守性，各毒株彼此間的核苷酸同源率在85.7%—100%，并且M蛋白與病毒的復制有關，是重要的免疫原基因［9］。

本研究根據雞傳染性支氣管炎病毒H120型基因序列設計引物，擴增出M基因，并克隆至真核表達載體pEGFP-C1-SCP-SEC上，以PEI 25000包裹質粒，完成核酸疫苗的制備，通過間接免疫熒光試驗驗證了其能在真核細胞內表達，通過動物免疫及攻毒試驗分析其免疫保護效果，對研制IBV核酸疫苗打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態細胞DH5α、改造好的真核表達載體pEGFP-C1-SCP-SEC均為上海市農業科學院畜牧獸醫研究所禽病防控研究室保存，改造好的質粒切去了EGFP基因，加入了SCP啟動子和SEC序列；雞傳染性支氣管炎H120株活疫苗購自哈藥集團生物疫苗有限公司；限制性內切酶Eco RI、Sal I、T4 DNA連接酶均購自Thermo Fisher Scientific公司；pMD18-T載體、rTaq酶、KOD酶購自寶生物工程有限公司；Trizol試劑購自上海生工生物公司；PEI 25000購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 病毒培養

將H120株弱毒活疫苗經PBS溶解，經尿囊腔接種8枚10—11日齡非免疫雞胚，每枚雞胚接種200μL，取2枚正常雞胚作對照，注入等量PBS，用石蠟封孔。棄去接毒后24 h內死亡的雞胚；孵育72 h后將雞胚放入4℃冰箱過夜，無菌收集尿囊液，尿囊液應為澄清顏色，黃色或紅色則不可用。

1.3 引物設計及IBV總RNA的提取

通過分析GenBank上已登錄的IBV-H120株M基因序列，利用軟件Primer Premier 5.0設計1對引物，在引物的上下游分別加入Eco RI、Sal I兩個酶切位點，引物由上海捷瑞生物公司合成。

斜體為引入的Eco RI和Sal I酶切位點，擴增片段為678 bp。參考Trizol試劑說明書用Trizol裂解法提取IBV尿囊液總RNA。

1.4 RT-PCR反應

反轉錄體系：取1.3提取的病毒RNA 4μL，加入dNTP 0.5μL，下游引物0.5μL（10μmol/L），在冰上混合后65℃水浴5min，取出立即放冰上2min；依次加入5×PrimeScriptReverse transcriptase Buffer2μL，RNase抑制劑0.5μL，PrimeScript Reverse Transcriptase（5 U/μL）1μL，DEPC水1.5μL，在冰上混合，42℃水浴1 h，然后70℃滅活15 min。

PCR反應體系：取cDNA 4μL，依次加入10×KOD Buffer 5μL，dNTP（2 mmol/L）5μL，MgSO44μL，上/下游引物（10μmol/L）各1.5μL，KOD-Plus酶2μL，ddH2O 27μL以補足50μL體系；PCR反應條件：94℃4 min；（94℃45 s；56℃45 s；68℃1 min）設35個循環；68℃10 min。

取5μL PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳檢驗是否擴增出目的片段。

1.5 PCR產物的克隆與序列測定

將檢驗正確的PCR產物用膠回收試劑盒進行回收，連接pMD18-T載體，轉化感受態細胞DH5α，在LBAmp＋板上涂布，37℃培養16 h后PCR篩選，篩選出陽性克隆后進行質粒雙酶切鑒定。鑒定陽性克隆命名為pMD18-IBV-M，送上海鉑尚生物公司測序。

1.6 pC1-IBV-M基因真核表達載體的構建與鑒定

用內切酶EcoR I、Sal I對pMD18-IBV-M質粒和pEGFP-C1-SCP-SEC載體雙酶切，回收目的片段，取回收產物16℃連接過夜。產物轉化感受態細胞DH5α，涂布LB Kan＋平板，37℃16 h后進行PCR篩選，篩選結果正確的進行大量培養后提取質粒并進行Eco RI、Sal I雙酶切，鑒定正確的質粒命名為pC1-IBV-M，送上海鉑尚生物公司測序。

1.7 pC1-IBV-M重組質粒的間接免疫熒光試驗

按照脂質體2000轉染說明書分別用不含血清的DMEM稀釋轉染試劑脂質體2000和C1-IBV-M，質粒用量為0.8μg/孔，轉染試劑的量約為質粒的2—2.5倍，稀釋后迅速混勻，室溫放置20 min，轉入Vero細胞中，同時設立不轉染的正常Vero細胞為陰性對照，6 h后換液，放入37℃5%CO2培養箱中培養48 h，將細胞培養液棄掉，加入預冷的75%乙醇，4℃冰箱預冷1 h，棄掉乙醇溶液，用PBS洗3次并風干，使有機溶劑揮發完全，每孔加入1∶50倍稀釋的IBV陽性血清200μL，37℃孵育1 h，用PBS洗滌3次，每孔加入1∶200倍稀釋的FITC標記兔抗雞IgG 400μL，37℃避光孵育1 h，用PBS洗3遍并風干，然后在熒光顯微鏡下觀察結果，并拍照。

1.8 H120株M基因真核表達載體的免疫保護性試驗

將大量提取的質粒與PEI 25000（1 mg/mL）按N/P＝8混合，輕微震蕩后離心混勻，室溫放置20 min直接腿部多點肌肉注射。

將7日齡雛雞隨機分為2組，每組5只，試驗組注射制備的真核表達載體100μg/只，另一組設為對照，注射PBS 500μL/只。一免1周后同劑量加強免疫1次，二免14 d后攻毒（200μL/只），連續觀察14 d后全部撲殺，取腎臟組織提取RNA進行病毒的檢測，以評判該核酸疫苗是否具有免疫保護性。

2 結果與分析

2.1 IBV-M基因的RT-PCR擴增

以提取的IBV尿囊液總RNA為模板，進行PCR擴增，擴增片段全長約678 bp（圖1）。

2.2 pMD18-IBV-M基因克隆篩選與酶切鑒定

以pMD18-IBV-M進行菌落PCR篩選，可檢測到約678 bp的基因片段（圖2）。

將pMD18-IBV-M質粒進行雙酶切，得到約2 692 bp和678 bp長度的2個片段，分別與pMD18-T載體和IBV-M基因片段一致（圖3）。比對測序結果，IBV-M基因大小正確。

圖1 IBV-M基因的PCR擴增Fig.1 PCR product of IBV-M

圖2 pMD18-IBV-M篩選陽性克隆Fig.2 PCR of bacterium drop of pMD18-IBV-M

2.3 真核表達載體構建和篩選

將C1-IBV-M重組質粒進行雙酶切，得到約4 731 bp和678 bp的2個片段，分別與C1-SCP-SEC載體和IBV-M基因片段一致（圖4）。比對測序結果，IBV-M基因大小正確，說明真核表達質粒pC1-IBV-M構建成功。

圖3 pMD18-IBV-M酶切鑒定Fig.3 Identification of the p lasm id pMD18-IBV-M

圖4 C1-SCP-SEC-IBV-M酶切鑒定Fig.4 Dentification of the recom binant p lasm id C1-SCP-SEC-IBV-M

2.4 重組質粒的間接免疫熒光試驗

重組質粒轉染Vero細胞后，經過48 h的培養進行免疫熒光試驗，通過熒光顯微鏡觀察試驗結果，根據是否有熒光來判斷免疫熒光的效果，在重組質粒的細胞孔內可以觀察到特定的綠色熒光，而陰性對照細胞內無綠色熒光（圖5），由觀察可知，構建的重組質粒pC1-IBV-M在Vero細胞中能夠表達，表達的蛋白能與IBV血清發生特異性結合。

圖5 重組質粒的免疫熒光試驗（40×）Fig.5 Immunofluorescence assay of recombinant p lasm id（40×）

2.5 C1-IBV-M重組質粒的免疫保護性

兩組動物攻毒后連續觀察14 d后全部撲殺，取腎臟組織提取RNA，進行病毒PCR鑒定。圖中泳道1—5為對照組均能檢測到病毒條帶，泳道6—10為疫苗組均未檢測到病毒。說明本研究制備的真核表達載體具備一定的免疫保護效果（圖6）。

圖6 動物試驗腎臟組織RT-PCR鑒定Fig.6 Identification of kidney RT-PCR

3 討論

IBV在世界范圍內廣泛流行，是高度接觸性呼吸道傳染病，主要侵害雞的呼吸系統，泌尿生殖系統和消化系統［6］。自從IBV被發現以來，人們就一直致力于IBV的防控，接種疫苗是預防控制IBV傳播的最有效手段［13］，普通疫苗的制備成本高，運輸和貯存條件要求較高，加上該病原不斷出現新的血清型，常導致免疫不成功，這使得普通疫苗在實踐應用中從根本上控制不了IB的流行，因此研制高效安全的IB疫苗，對防控和治療IB具有重大意義［14-18］。隨著分子生物學的飛速發展，人們對病毒基因組的結構及其主要免疫功能有了越來越深入的了解，開發研制IB基因工程疫苗，克服傳統疫苗的不足之處，已成為未來IB疫苗研制越來越熱門的方向［20-21］。

DNA疫苗是指將具有保護性免疫應答的目的基因克隆至真核質粒載體，然后將重組質粒導入機體，它會通過宿主體內的轉錄系統表達目的抗原，從而刺激機體產生保護性免疫應答的一種生物制劑［21］。其中目的基因的選擇至關重要，通常選擇該病原主要的保護性抗原基因，一般選擇對大多數毒株都有保護作用的抗原基因，其表達產物能誘導機體產生保護性的免疫反應。

有研究表明，M基因保守性高于S1基因而低于N基因［9］，將國內外參考毒株相比較發現彼此之間核苷酸同源率很高，為85%—100%。本研究將擴增的IBV-M基因與GenBank上登錄的參考株相比，發現同源率在94%—100%，說明M基因變異性小，這與文獻報道一致［23-25］。另有研究表明，M基因能刺激機體產生抗體，在M基因的N端能形成抗原決定簇，能誘導細胞介導的免疫反應［24］。

本試驗選擇IBV H120株的M基因作為真核表達載體的免疫原基因，將M基因插入改造好的真核表達載體pEFGP-C1-SCP-SEC載體上，通過酶切鑒定和比對測序結果，成功構建IBV-M的真核表達載體，通過動物試驗驗證了其具有一定的免疫保護性：圖6中泳道1—5為對照組均能檢測到病毒條帶，但是存在非特異性條帶，分析原因認為，此非特異性擴增條帶為引物自聚體，不影響試驗結果。此結果表明了M基因能刺激機體產生特異性抗體，可以保護機體免受病毒的攻擊，這與其他研究結果基本一致，為進一步研究IBV的DNA疫苗奠定了基礎。

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（責任編輯：張睿）

Construction of DNA vaccine bearing M gene of chicken infectious bronchitis virus and evolution of its immune efficacy

SUN Xiao-yun1，2，LIU Cheng-qian2，YIJian-zhong2，LIHong2
（1College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China；2Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China）

According to the M gene sequence of chicken infectious bronchitis H120，the primers were designed and synthesized.The total RNA was acquired from allantois fluid，M gene was amplified by using PCR technology.The plasmid of pMD18-IBV-M was cloned and then the M gene was inserted into pEGFP-C1-SCP-SEC vector which has been modified to construct the eukaryotic expression vector pC1-IBV-M.The animal’s immune protection was detected by indirect immunofluorscence（IFA）and animal experiment.

Chicken Infectious Bronchitis virus；M gene；Animal experiment

S831.7；S851.3

：A

1000-3924（2017）02-104-05

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.19

2016-05-25

上海市科技人才計劃（14YF1414600）；上海市農業科學院中青年科技人員“助跑”計劃

孫曉云（1989—），女，碩士，主要從事動物疾病的分子生物學及免疫學研究。E-mail：sunyun0529＠163.com

，E-mail：lihong20061029＠163.com