超聲波輔助魚皮膠原蛋白提取及其性質(zhì)研究

王金梅，包建強(qiáng)

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

超聲波輔助魚皮膠原蛋白提取及其性質(zhì)研究

王金梅，包建強(qiáng)

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

利用超聲波輔助提取草魚皮膠原蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE、圓二色譜法對(duì)超聲作用得到的草魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)和變性溫度等進(jìn)行了研究。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到最優(yōu)工藝條件：超聲功率310 W，超聲時(shí)間10 min，酶解時(shí)間29 h，提取率達(dá)到68.67%。SDS-PAGE和CD顯示：膠原蛋白為典型Ⅰ型，且純度較高，變性溫度為36℃，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)完整，超聲波對(duì)其結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，且具有生物活性。

魚皮；膠原蛋白；提取；超聲波；凝膠電泳；圓二色譜；響應(yīng)面分析

我國(guó)淡水產(chǎn)品年產(chǎn)量長(zhǎng)期位居世界第一，2014年淡水魚總產(chǎn)量達(dá)到2 770萬(wàn)t，占全國(guó)魚類產(chǎn)量的73%［1］。為提高淡水魚的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)淡水魚進(jìn)行深加工是目前面臨的重要問(wèn)題。2012年我國(guó)水品加工比例僅占36.15%［2］，淡水產(chǎn)品加工比例更低僅為17%，淡水產(chǎn)品加工利用率低，低附加值的產(chǎn)品多，深加工的產(chǎn)品少的現(xiàn)象普遍存在，例如魚糜加工業(yè)的采肉率僅為25%左右［2］，其余60%—70%的魚體部分成了加工副產(chǎn)品，大量副產(chǎn)品沒(méi)有得到綜合利用，還對(duì)環(huán)境造成污染。研究表明：魚皮膠原蛋白含量豐富，郭文宇等［3］測(cè)得草魚皮膠原蛋白量可達(dá)總蛋白含量80%以上，經(jīng)加工處理可得到高品質(zhì)的膠原蛋白。

膠原蛋白的提取方法主要有：水法提取、堿法提取、酸法提取和酶法提取。熱水法提取的膠原蛋白由于超螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，因而不具備膠原蛋白的生理功能，這類膠原蛋白被稱為明膠；堿法提取過(guò)程中會(huì)使膠原部分肽鍵水解，破壞其超螺旋結(jié)構(gòu)，所以得到膠原蛋白分子量較小，且堿法水解過(guò)度會(huì)產(chǎn)生有毒的D型氨基酸旋光化合物，所以堿法提取膠原蛋白研究較少；酸法提取常與酶法結(jié)合使用，蛋白酶可以切除膠原蛋白末端的非膠原肽，使膠原蛋白溶解于酸或中性鹽溶液中從而被提取出來(lái)。張雙靈等［4］研究當(dāng)酶劑量為1.2%、酶解時(shí)間80 min、酶解溫度55℃、酶解pH＝9時(shí)，虹鱒魚皮膠原蛋白得率為26.1%。

近年來(lái)超聲波在成分提取方面應(yīng)用廣泛，楊萌萌等［5］將超聲波應(yīng)用到提取牛蹄筋的酶溶性膠原蛋白中，研究了超聲功率與超聲時(shí)間及加酶量三個(gè)因素對(duì)提取率的影響，得到最優(yōu)條件下提取率提高了1069%。本研究將超聲波應(yīng)用到草魚皮膠原蛋白提取中，并通過(guò)響應(yīng)面確定超聲波的最優(yōu)工作參數(shù)。由于水產(chǎn)品膠原蛋白不同于一般動(dòng)物膠原蛋白，水產(chǎn)品膠原蛋白變性溫度較低，有生物學(xué)功能的三螺旋結(jié)構(gòu)容易在提取過(guò)程中被破壞，所以，采用圓二色譜法研究了膠原蛋白的熱穩(wěn)定性以及超聲波對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)室－50℃凍藏新鮮草魚魚皮，南潯新雅農(nóng)產(chǎn)品（浙江）開發(fā)有限公司提供。胃蛋白酶酶活3 000 U/g和羥脯氨酸等藥品，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。

UV-18OOPC型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；XO-SM100超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，先歐儀器（南京）制造有限公司；圓二色譜儀J-815，JASCO公司。

1.2 草魚皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化

1.2.1 膠原蛋白提取及純化

魚皮室溫流水解凍，刮掉魚皮表面殘留魚肉，剪碎稱重，氫氧化鈉浸泡除去雜蛋白，水洗至中性，正丁醇浸泡除脂，水洗，加乙酸，超聲處理［4］，加酶浸泡，離心取上清液，加Tris調(diào)節(jié)pH，加入氯化鈉進(jìn)行鹽析，離心取沉淀，加乙酸復(fù)溶，低濃度乙酸中透析，冷凍干燥得膠原蛋白樣品。

1.2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

膠原蛋白中含有的羥脯氨酸含量相對(duì)穩(wěn)定，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定羥脯氨酸含量，乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)得到樣品中膠原蛋白含量。通過(guò)Woessner比色法可得到有關(guān)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度值可計(jì)算羥脯氨酸含量［6］，不同于一般動(dòng)物的膠原羥脯氨酸含量（14.4%），魚類膠原中含量略低，如Ikoma等［7］測(cè)得淡水魚鱗膠原中羥脯氨酸的含量約為11%，本次研究取9.09［8］。

酶解液中膠原蛋白得率（W，%）和提取率（Y，%）換算公式如下所示：

式中：ω為酶解液中羥脯氨酸的質(zhì)量。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

試驗(yàn)考察超聲頻率、超聲時(shí)間和酶解時(shí)間三個(gè)因素對(duì)膠原蛋白提取率的影響，通過(guò)單因素預(yù)試驗(yàn)，確定響應(yīng)面因素水平，應(yīng)用Box-Behnken模型以A超聲頻率、B超聲時(shí)間和C酶解時(shí)間為自變量，膠原蛋白得率Y為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)，經(jīng)預(yù)處理后的魚皮提取條件為0.5 mol/L的乙酸以調(diào)節(jié)pH，料液比1∶15，進(jìn)行超聲波處理后加入胃蛋白酶量為4%。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface

1.3 膠原蛋白聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

SDS-PAGE參照Matmaroh等［9］的方法。膠原蛋白分離采用8%的SDS/聚丙烯酰胺凝膠、Tris-HCl/甘氨酸電泳緩沖系統(tǒng)。膠原蛋白溶于去離子水（1 mg/mL）后，與上樣緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl，4%SDS，20%甘油，含或不含10%DTT，pH 6.8）以1∶1（V/V）混合，沸水浴5 min。樣品冷卻后，加入4%聚丙烯酰胺凝膠（濃縮膠）梳孔，冰浴電泳120 V。電泳結(jié)束后，凝膠用0.05%考馬斯亮藍(lán)R-250染色，用含15%甲醇和10%乙酸的脫色液脫去背景色。

1.4 熱穩(wěn)定性的圓二色譜測(cè)試

1.4.1 膠原蛋白結(jié)構(gòu)鑒定

將凍干膠原蛋白溶解到0.1 mol/L的乙酸溶液，樣品質(zhì)量濃度為200μg/mL，取200μL注入1 mm比色皿中放入樣品池。設(shè)置溫度10℃，掃描速率10 nm/min，掃描波長(zhǎng)范圍190—250 nm，數(shù)據(jù)點(diǎn)間隔0.5 nm，圓二色譜儀記錄橢圓率變化。

1.4.2 膠原蛋白熱穩(wěn)定性和不可逆性

設(shè)置波長(zhǎng)220 nm，樣品池溫度從10℃升高到45℃，升溫速度1℃/min，圓二色譜儀記錄升溫過(guò)程中數(shù)據(jù)變化。將膠原蛋白45℃處理后，降溫到10℃保溫20 min，10℃環(huán)境中記錄190—250 nm波長(zhǎng)范圍的橢圓率變化。

1.4.3 溫度對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)影響

測(cè)試樣品配制方法同1.4.1，試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)不同的溫度點(diǎn)，20℃、30℃、35℃、60℃、80℃，掃描波長(zhǎng)范圍190—250 nm，每個(gè)溫度點(diǎn)掃描，記錄數(shù)據(jù)，保溫10 min后，再次掃描記錄數(shù)據(jù)，掃描速率設(shè)置為100 nm/min。

1.4.4 超聲波對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響

將配置好的膠原蛋白溶液放到超聲清洗器處理，功率300W，分別超聲處理5 min、10 min、15 min，記錄橢圓率變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚皮膠原蛋白提取的工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert8.0.6設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示，表3為方差分析數(shù)據(jù)。其中回歸模型系數(shù)的顯著性P＜0.01，回歸模型顯著，失擬項(xiàng)P＝0.2745＞0.05不顯著，表明方程模擬比較好，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)響應(yīng)面回歸模型：Y＝66.87＋1.13A＋2.42B＋4.31C＋0.34AB－0.86AC－2.51BC－2.42A2－3.36B2－2.46C2，可知各因素對(duì)草魚皮中膠原蛋白提取率影響的主次順序?yàn)椋篊＞B＞A，即酶解時(shí)間＞超聲時(shí)間＞超聲功率，酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響最大，其次是超聲時(shí)間。

表2 試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experim ental design and results

表3 回歸模型的方差分析及其系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis of regression m odel and significance test ofm odel coefficients

根據(jù)方差分析數(shù)據(jù)顯示，酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響極顯著，超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響顯著；三因素兩兩交互作用分析，超聲時(shí)間與酶解時(shí)間之間的交互作用對(duì)提取率的影響顯著，超聲功率和超聲時(shí)間、酶解時(shí)間和超聲功率響之間的交互作用影響不顯著。

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化，酶法提取得到草皮膠原蛋白最優(yōu)可操作的工藝條件為：超聲功率312.97 W，超聲時(shí)間10.29 min，酶解時(shí)間29.12 h，此時(shí)膠原蛋白提取率理論值為68.80%。考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的需要，上述工藝條件進(jìn)行略微調(diào)整，最終確定實(shí)際最優(yōu)的提取工藝為：超聲功率310W，超聲時(shí)間10min，酶解時(shí)間29 h，并在此最優(yōu)條件下對(duì)其進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，以考察模型的可靠性。結(jié)果表明：在實(shí)際的最優(yōu)工藝條件下，超聲波輔助提取下的膠原蛋白提取率達(dá)到68.67%，實(shí)際操作中的數(shù)值與試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的理論數(shù)值（68.80%）相對(duì)誤差僅為0.19%。

2.2 凝膠電泳

超聲波輔助提取（UPSC）與未經(jīng)超聲波波處理所得的膠原蛋白（PSC）的電泳圖譜如圖1所示，所得膠原蛋白與標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原蛋白條帶基本一致，均存在兩條不同的α鏈，是由α1和α2組成，其中從光密度來(lái)看α1和α2的比率為2∶1，因此膠原蛋白的組成應(yīng)該為（α1）2α2這種結(jié)構(gòu)符合真骨魚膠原含有兩條［10-11］或者三條［12］不同的鏈，根據(jù)與Maker對(duì)比，可以確定為Ⅰ型膠原蛋白，圖1是另一條帶為β，是兩條肽鏈的二聚體，符合魚皮Ⅰ型膠原結(jié)構(gòu)，且圖1中電泳條帶清晰無(wú)雜帶出現(xiàn)，說(shuō)明超聲波輔助酶法提取膠原蛋白純度較高。圖1中2和4對(duì)比，4和5對(duì)比發(fā)現(xiàn)，相同濃度的UPSC和PSC條帶位置和條帶密度均大致相同，表明超聲波輔助提取沒(méi)有破壞膠原蛋白的結(jié)構(gòu)。

2.3 熱穩(wěn)定性的圓二色譜測(cè)試

2.3.1 膠原蛋白結(jié)構(gòu)的圓二色譜測(cè)試

圖2為圓二色譜儀掃描得到的膠原蛋白CD譜圖。圖2中10℃測(cè)定的CD譜圖曲線，可以看到膠原蛋白在190—250 nm有正負(fù)兩個(gè)吸收峰，最大負(fù)吸收峰在198 nm左右，最大正吸收峰在220 nm左右，并由正負(fù)峰強(qiáng)度比值可以表征膠原三螺旋結(jié)構(gòu)完整程度［13］，完全符合膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的吸收特征峰，說(shuō)明提取得到膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)完整。圖2中膠原蛋白溶液加溫到45℃后降溫到10℃并保溫一段時(shí)間，圓二色譜儀記錄190—250 nm波長(zhǎng)范圍的色譜圖，圖中沒(méi)有明顯的正負(fù)吸收峰，表明膠原蛋白在超過(guò)一定溫度后已經(jīng)變性解螺旋，降低溫度后，三螺旋結(jié)構(gòu)不能恢復(fù)，二級(jí)結(jié)構(gòu)已被破壞。

圖1 膠原蛋白SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of grass carp skin’s collagen

圖2 草魚皮膠原蛋白圓二色譜掃描Fig.2 Circular dichroism spectra of grass carp skin’s collagen

2.3.2 膠原蛋白熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不可逆性測(cè)試

CD譜圖上波長(zhǎng)220 nm處的摩爾橢圓率表示膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收光值譜，此波長(zhǎng)處的CD值隨溫度的變化則可表征膠原蛋白三螺旋構(gòu)象的變化過(guò)程［14］。對(duì)膠原蛋白溶液從10℃升高到45℃，記錄橢圓率變化如圖3（a），圖3（a）中顯示10—31℃，膠原蛋白CD值幾乎沒(méi)有變化，在31—34℃范圍內(nèi)CD值有略微減小，而在大于34℃到39℃范圍內(nèi)，CD值迅速減小。表示三股螺旋結(jié)構(gòu)在34℃以前一直完整存在，之后三螺旋的α單鏈開始解旋，在溫度大于39℃時(shí)，CD又變得穩(wěn)定，表示三螺旋結(jié)構(gòu)徹底破壞。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行微積分處理得到圖3（b），可以得到在36℃時(shí)，膠原蛋白的解螺旋速率最大［15］，所以草魚皮膠原蛋白的變性溫度為36℃。

圖3 草魚皮膠原蛋白解螺旋過(guò)程Fig.3 Uncoiling of grass carp skin’s collagen

2.3.3 溫度對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)影響測(cè)試

圖4是保溫前后不同溫度下膠原蛋白的CD曲線，設(shè)置五個(gè)溫度點(diǎn)，對(duì)每個(gè)溫度點(diǎn)的樣品進(jìn)行兩次掃描，分別保溫10 min。圖4中（a）和（b）在接近變性溫度的30℃，保溫前后圖譜并沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明在變性溫度之前膠原蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；溫度點(diǎn)位35℃，正負(fù)峰比值RPN有略微變化，保溫10 min后，其正負(fù)峰強(qiáng)度變化很大，RPN減小明顯。溫度點(diǎn)60℃時(shí)，保溫10 min正峰強(qiáng)度幾乎為零，負(fù)峰發(fā)生紅移。由此得出結(jié)論，膠原蛋白在變性溫度前，結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，并且膠原蛋白解螺旋改變結(jié)構(gòu)需要一段時(shí)間過(guò)程。

圖4 不同溫度點(diǎn)膠原蛋白圓二色譜Fig.4 Circular dichroism spectra of collagen at different temperatures

2.3.4 超聲波對(duì)膠原蛋白圓二色性的影響

對(duì)膠原蛋白溶液進(jìn)行一定時(shí)間的超聲波處理后測(cè)得圓二色譜如圖5，在功率300 W，作用不同超聲時(shí)間的圖譜與沒(méi)有進(jìn)行超聲處理的膠原蛋白對(duì)比沒(méi)有明顯區(qū)別，說(shuō)明超聲波對(duì)膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)不會(huì)造成影響；并且CD圖譜顯示在220 nm和198 nm左右有兩個(gè)吸收峰說(shuō)明超聲處理過(guò)的膠原蛋白仍具有生理活性。

圖5 不同超聲時(shí)間的膠原蛋白圓二色譜Fig.5 Circular dichroism spectra of collagen at different ultrasonication times

3 結(jié)論

本研究將超聲波作用到魚皮膠原蛋白提取中，并通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)法獲得最佳工藝參數(shù)：超聲波功率310 W，超聲波時(shí)間10 min，酶解時(shí)間29 h，此條件下膠原蛋白提取率為68.67%。超聲波輔助法比未經(jīng)超聲處理的提取法得到膠原蛋白得率提高了13.38%。

SDS-PAGE顯示膠原蛋白純度較高，且結(jié)構(gòu)符合標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原蛋白；圓二色譜法測(cè)定膠原蛋白結(jié)構(gòu)，判定其具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)；測(cè)得魚皮膠原蛋白變性溫度為36℃，且其結(jié)構(gòu)改變需要一定時(shí)間；對(duì)比溫度對(duì)膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)論是超聲波對(duì)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)影響不大，超聲波輔助提取過(guò)程不足以對(duì)膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)造成影響，超聲輔助提取得到的草魚皮膠原蛋白仍然具有生物活性。

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（責(zé)任編輯：程智強(qiáng)）

The ultrasonic-assisted solvent extraction and characterization of fishskin collagen

WANG Jin-mei，BAO Jian-qiang
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

The ultrasonic-assisted solventextraction of grass carp skin’s collagen was carried out，and the gained collagen’s structure and denaturing temperature were studied by SDS-PAGE and circular dichroism spectrocopy.The experiments by response surface methodology showed that the optimal processing conditions were 310-W ultrasonic power，10-min ultrasonication and 29-h enzymolysis，in which the extraction rate reached 68.67%.The research by SDS-PAGE and circular dichroism spectrocopy indicated that the collagen was of TypeⅠand had a comparatively high purity，its denaturing temperature was 36℃，and its triple-helix structure was intact and not influenced by ultrasonic wave，and also had a biological activity.

Fishskin；Collagen；Extraction；Ultrasonic wave；Gel electrophoresis；Circular dichroism spectrum；Response surface analysis

TS254

：A

1000-3924（2017）02-114-06

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.21

2016-04-06

水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（ZF1206）；上海市科委工程中心建設(shè)（11DZ2280300）

王金梅（1990—），女，碩士，研究方向：食品科學(xué)。Tel：15216835916，E-mail：wjmytu＠163.com

，E-mail：baojq＠shou.edu.cn