復(fù)方黃櫨口服液中總黃酮含量測定方法

郝少君，李文俊，高延玲，蘇 峰，張正臣

復(fù)方黃櫨口服液為臨床應(yīng)用多年的中藥制劑，由黃櫨、五味子、垂盆草、枸杞、梔子、大棗等六味中藥組成。除濕清熱，退黃降酶，用于急性黃疸型肝炎，慢性肝炎。文獻(xiàn)報(bào)道［1］，黃櫨所含的黃酮類、多酚類等物質(zhì)可用于高血壓、黃疸性肝炎等的防治；五味子富含黃酮類木脂素、多糖、揮發(fā)油及其他多種化學(xué)成分，具有保肝益腎、保護(hù)心腦血管、鎮(zhèn)靜、催眠等多種功能［2，3］；垂盆草［4］主要含有糖類、黃酮類、三帖類及苷類成分，垂盆草總黃酮［5］是垂盆草中重要的保肝降酶活性成分之一，且垂盆草總黃酮至少含有槲皮素、山柰素、木犀草素等8種黃酮類化合物；寧夏枸杞［6］的主要活性成分含量——枸杞多糖、總糖、甜菜堿；梔子［7］的化合物有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、有機(jī)酸酯類、多糖類、醛類、醇類、長鏈烷烴類等；大棗［8］主要成分為糖類、有機(jī)酸及其酯類、皂苷類、生物堿類、黃酮類等。

以上可知，黃酮類成分為方中的主要有效成分。該文以蘆丁為對照品，利用黃酮類化合物的3，5－羥基與Al3+生成絡(luò)合物，在可見光區(qū)有最大吸收的特點(diǎn)，采用紫外分光光度法［9－14］測定黃酮的含量，為建立該復(fù)方黃櫨口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 752N紫外可見分光光度計(jì) （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；AB135－S電子天平 （梅特勒－托利多集團(tuán)）。

1.2 試藥 蘆丁對照品 （批號：100080－201409 CAS號：153－18－4）購自中國食品藥品檢定研究院；水為純化水；其他試劑均為分析純。復(fù)方黃櫨口服液（批號：20150608、20150712、20150820）由該院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品50 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加70%乙醇20 ml，置水浴上微熱使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得對照品溶液（每1 ml含蘆丁0.2 mg）。

2.2 供試品溶液的制備 精密量取復(fù)方黃櫨口服液5 ml，置 50 ml量瓶中，加70%乙醇40 ml，置水浴上微熱使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5 ml，置50 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 檢測波長的選擇 精密量取對照品溶液1 ml，置于25 ml容量瓶中，加水5 ml，加入5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，放置6 min，后加入10%硝酸鋁溶液1 ml，混勻，放置6 min，再加入10 ml氫氧化鈉試液，加水至刻度，搖勻，放置15 min，同時(shí)以相應(yīng)的試劑做空白對照，照紫外－可見分光光度法，測定波長在400～600 nm區(qū)段內(nèi)的吸光度，結(jié)果在505 nm波長處有最大吸收，因此選定510 nm為檢測波長。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分別置 25 ml量瓶中，各加水至6.0 ml，加 5%亞硝酸鈉溶液1 ml，混勻，放置6 min，加 10%硝酸鋁溶液 1 ml，混勻，放置 6 min，加氫氧化鈉試液（取氫氧化鈉4.3 g，加水使溶解成100 ml，即得）10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min；以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外－可見分光光度法，在505 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=9.5385C+0.097（r=0.9997），表明蘆丁在8～48 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 總黃酮含量測定 精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下的方法，自“加水至6.0 ml”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的量，計(jì)算即得。平行測定3次，結(jié)果三批復(fù)方黃櫨口服液的總黃酮含量平均為32.75 mg/ml。結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方黃櫨口服液中總黃酮的含量測定（n=3）

2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取同一批 （批號：20150820）樣品供試品溶液2 ml，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下方法，自“加水至6.0 ml”起依法測定吸光度A值，平行測定5次。結(jié)果見表2。表明本方法精密度良好。

表2 復(fù)方黃櫨口服液的精密度試驗(yàn)（n=5）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號：20150820）2 ml，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下方法，自“加水至6.0 ml”起，依法顯色后放置不同時(shí)間進(jìn)行測定，每隔5 min測定1次吸光度。結(jié)果見表3。

表3 復(fù)方黃櫨口服液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果測得的RSD值為0.64%，表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方黃櫨口服液樣品，分別精密量取本品5 ml，共5份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5”項(xiàng)下方法，依法顯色后測定總黃酮含量，結(jié)果RSD為1.67%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品溶液（0.3184 mg/ml）共 6份各 1 ml，分別精密加入不同量的對照品溶液（0.2 mg/ml），照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下的方法，自“加水至6.0 ml”起依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果該方法的平均回收率為99.38%，RSD為1.57%。

3 討論

甲、乙、丙型肝炎損害肝功能、危及生命、易引起并發(fā)癥，是法定乙類傳染病，具有傳染性較強(qiáng)、傳播途徑復(fù)雜、流行面廣泛、發(fā)病率高等特點(diǎn)。目前雖然有一些中、西藥治療方式，但是療效仍不理想，不能較好的治療各型肝炎且有不同程度的不良反應(yīng)，給患者帶來較大的痛苦。西藥雖見效快，但不良反應(yīng)大，亦有導(dǎo)致中斷治療的現(xiàn)象。鑒于此根據(jù)多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，該方劑由筆者所在醫(yī)院藥械科與肝病科合作，研制了復(fù)方黃櫨口服液，方由黃櫨、五味子、垂盆草、枸杞、梔子、大棗等六味中藥組成。

方中黃櫨［15，16］清熱解毒，散瘀鎮(zhèn)痛，具有抗菌消炎、退熱消腫等功效，含有黃酮、沒食子酸等多種化學(xué)成分，也是我國傳統(tǒng)藥用植物，可用于治療黃疸型肝炎、水火燙傷、感冒、牙齦炎，為君藥。五味子［17］可斂肺滋腎，生津斂汗，澀精止瀉，寧心安神，降低血清轉(zhuǎn)氨酶，保肝利膽，能增加機(jī)體對非特異性刺激的防御能力；垂盆草具有清熱解毒、清利濕熱的功效，有文獻(xiàn)報(bào)道垂盆草有保肝降酶的作用，并證實(shí)了垂盆草的保肝降酶的主要活性成分存在于苷類和總黃酮，而垂盆草顆粒是由鮮垂盆草經(jīng)提取、制粒制備而成的中成藥，用于急慢性肝炎濕熱瘀結(jié)證，以上二味藥為臣藥。枸杞子能補(bǔ)血明目，為滋陰助陽，益精補(bǔ)血之良藥；梔子［18］具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒的功效，主治熱病心煩，肝火目赤，頭痛，濕熱黃疳，藥理作用表明梔子具有抗氧化、抗炎、抗自由基損傷、促進(jìn)膽汁分泌、抗病毒、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用，以上二藥為佐藥。大棗可補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血安神，緩和藥性，有提高體內(nèi)單核－吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能，保護(hù)肝等作用，為使藥。諸藥合用，以達(dá)到除濕清熱、退黃降酶的作用，用于急性黃疸型肝炎，慢性乙型肝炎。

該實(shí)驗(yàn)首次從復(fù)方黃櫨口服液中提取出總黃酮并測定了其含量，為建立該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。結(jié)果表明，利用紫外分光光度法對復(fù)方黃櫨口服液中總黃酮含量進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)條件容易控制，操作簡單，重現(xiàn)性好，可作為測定黃酮類化合物的常用方法。

在該實(shí)驗(yàn)中采用硝酸鋁作為黃酮類物質(zhì)比色測定的顯色劑，主要是因?yàn)辄S酮母核中含有堿性氧原子，一般又多帶酚羥基，能和鋁離子產(chǎn)生黃色絡(luò)合物。加入亞硝酸鈉和氫氧化鈉，可使之在堿性溶液中顯紅色，顯色反應(yīng)要及時(shí)測定，放置過久易褪色。

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