槲皮素在HepG2細胞中抑制膽固醇蓄積所致的炎性反應

王煉詞

【摘 要】目的：研究槲皮素（Quercetin）對HepG2細胞膽固醇蓄積所致炎性反應的抑制作用及機制。方法：雙熒光素酶報告基因活性試劑盒檢測槲皮素對人NPC1L1啟動子活性的影響，熒光定量PCR檢測NPC1L1 結果：槲皮素可劑量依賴性抑制NPC1L1啟動子的活性和NPC1L1 mRNA的表達；結論：槲皮素可通過抑制NPC1L1啟動子的活性下調(diào)其表達，從而實現(xiàn)對膽固醇蓄積所致炎性反應的抑制作用。

【關鍵詞】槲皮素 NPC1L1表達 膽固醇攝取 炎癥反應

人NPC1L1蛋白在肝臟表達豐富，位于肝細胞基底膜，負責重吸收膽汁中的游離膽固醇入肝[1]。研究還發(fā)現(xiàn)，NPC1L1是新型降脂藥物依澤替米貝（ezetimibe）的分子靶點， ezetimibe通過阻斷NPC1L1進而減少小腸及肝臟對膽固醇的吸收[2]。體外和體內(nèi)研究均報道，ezetimibe可顯著改善膽固醇負荷導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、抑制炎癥反應以及肝臟損傷。因此，NPC1L1成為NASH治療的一個新的候選靶點。

槲皮素（quercetin）是一種常見的植物雌激素，也是異黃酮類化合物的主要成份之一。現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有廣泛的藥理作用，具有抗氧化、降血脂和抗腫瘤等效應[3]。研究顯示槲皮素可調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)的代謝，但對NASH的防治作用還不清楚。基于上述報道，我們開展本實驗探討槲皮素對NPC1L1啟動子活性的影響，從而對其介導的膽固醇負荷和炎性反應的影響及可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細胞株HepG2來自武漢大學細胞典藏中心（武漢，中國），人NPC1L1啟動子雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL4.17-hNPC1L1）及內(nèi)參質(zhì)粒由婁曉亞博士惠贈（中南大學林藥理研究所，長沙，中國），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購于Gibco 公司（美國），DMSO、槲皮素和水溶性膽固醇購于Sigma 公司（美國），ezetimibe購自TRC公司（加拿大），細胞增殖活力檢測試劑盒和雙熒光素酶報告基因活力檢測試劑盒購自Promega公司（美國），Lipofectamine2000、Trizol、TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購于Invitrogen公司（美國），逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司（日本），細胞內(nèi)總膽固醇檢測試劑盒購自普利萊公司（中國，北京）。

1.2 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37度含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。HepG2細胞用0.25%的胰酶消化后鋪板（96孔），達到60-70%融合時用不同濃度槲皮素（2.5、5、10、20、40μM）進行處理。

1.3 雙熒光素報告基因活性檢測

HepG2細胞消化后鋪板（24孔），達到60-70%融合時，用lipofectamine2000按照說明書轉染pGL4.17-hNPC1L1和內(nèi)參質(zhì)粒，轉染24小時后用不同濃度槲皮素（5、10、20、40μM）處理24小時，按照說明，使用Promega雙熒光素酶報告基因活力檢測試劑盒檢測其活性并分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SPSS18.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean+SD）表示。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 槲皮素對NPC1L1啟動子活性的影響

我們利用雙熒光素酶報告基因實驗檢測槲皮素對NPC1L1啟動子活性的影響，HepG2細胞轉染pGL.17-hNPC1L1質(zhì)粒及內(nèi)參質(zhì)粒24小時后，不同濃度槲皮素處理（5、10、20、40μM）處理24小時，再用試劑盒檢測其活性，結果發(fā)現(xiàn)，如圖1所示，與DMSO組相比，槲皮素可濃度依賴性抑制NPC1L1啟動子的活性，10μM槲皮素即可顯著下調(diào)NPC1L1啟動子的活性。

2.2 槲皮素下調(diào)HepG2細胞中NPC1L1的mRNA表達水平

不同濃度（5、10、20μM）槲皮素處理HepG2細胞24小時后提取RNA進行定量，觀察槲皮素對NPC1L1 表達水平影響。從圖2知，與DMSO組相比，槲皮素處理可劑量依賴性顯著下調(diào)NPC1L1 mRNA水平。

3 討論

近年來，隨著生活水平的改善，我國NASH的發(fā)病率逐年增高，但缺乏有效的預防和治療方法。有研究發(fā)現(xiàn)，NASH的發(fā)病與肝臟膽固醇負荷密切相關[4]。研究標明，肝臟膽固醇的過度蓄積可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，通過引發(fā)線粒體損傷以及肝kuffer細胞和星狀細胞的活化，最終導致胰島素抵抗和炎癥反應，造成肝臟的損傷[5]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素可下調(diào)肝細胞NPC1L1啟動子活性，進而下調(diào)HepG2細胞NPC1L1的表達；抑制NPC1L1介導的膽固醇蓄積及炎癥反應。

人體膽固醇水平的動態(tài)平衡受到膽固醇的自身合成、小腸對膽固醇的吸收以及膽汁膽固醇的分泌三條途徑的嚴格控制。人NPC1L1蛋白是小腸和肝臟（重）吸收膽固醇的關鍵蛋白，因此NPC1L1表達的高低對于維持全身及肝臟膽固醇動態(tài)平衡有著重要的意義[6]。多種脂質(zhì)代謝相關的轉錄因子參與了NPC1L1的表達調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，SREBP2和PPARα可與NPC1L1啟動子區(qū)域特異性序列結合，說明兩者可通過直接結合NPC1L1啟動子上調(diào)其表達[7]。已有報道，槲皮素可通過抑制多種轉錄因子如SREBP-1c及PPARα的表達減少脂質(zhì)的生成[8]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制NPC1L1啟動子活性進而下調(diào)肝細胞中NPC1L1的表達，其機制可能是通過PPARα途徑進行調(diào)控。

參考文獻：

[1] Charlton MR， Burns JM， Pedersen RA， sing RA.et al. Frequency and outcomes of liver transplantation for nonalcoholic steatohepatitis in the United States [J]. Gastroenterology， 2011；141：1249-53.