p38MAPK抑制劑CBS3830對糖尿病大鼠自體靜脈移植內膜增生的影響及機制探討

鄔 松,葛建軍,趙智偉,劉永志,周經月

(安徽醫科大學第一附屬醫院,合肥 230022)

糖尿病(DM)患者70%～80%死于心血管系統并發癥[1],其中 3/4死于冠狀動脈疾病[2],且大多為 2～3支冠脈受累。利用自體靜脈行冠狀動脈旁路移植術(CABG)是治療冠狀動脈多支病變的常用方法,但術后靜脈橋狹窄率較高。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的新成員,參與多種細胞的胞內信號傳遞。研究發現,p38MAPK信號傳導通路與靜脈橋狹窄的發生密切相關。2009年11月 ～2010年 6月,我們建立糖尿病大鼠自體靜脈移植模型,觀察p38MAPK抑制劑CBS3830對大鼠自體移植靜脈內膜增生的影響,并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠30只,均為雄性,體質量200～250 g,6～8周齡。CBS3830及其溶媒1%甲基纖維素,鏈脲佐菌素(STZ)。大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒,HE染色試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 大鼠糖尿病模型的建立 30只大鼠禁食(不禁水)18 h,將STZ溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH 4.4),行腹腔注射60 mg/kg;72 h后尾靜脈采血,用血糖儀測定血糖,血糖＞16.7 mmol/L為造模成功。26只大鼠成模,其余大鼠剔除。

1.2.2 動物分組及處理 糖尿病大鼠隨機分為對照組及藥物組,各13只,采用改良cuff法將右頸外靜脈連接于同側頸總動脈之間,建立自體靜脈移植模型[3]。造模前1 h藥物組經胃管灌入0.3 mg/m l的CBS3830 1m l/100 g,對照組同法給予等體積的CBS3830溶媒1%甲基纖維素。術后分籠飼養,喂標準食物,自由飲水,不用胰島素。

1.2.3 血清TNF-α檢測方法 分別于術前及術后1、3、7 d從大鼠眼球后靜脈采血,離心后取血清備用。采用ELSIA法測定血清TNF-α,嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 大鼠移植靜脈內膜增生情況觀察 術后 1周處死動物,用4%中性甲醛在體固定移植靜脈;取出移植靜脈繼續用甲醛固定24 h,常規石蠟包埋,切片厚約 5μm,按參考文獻[4]的方法行 HE染色,采用計算機圖像分析系統采集圖像。每個標本隨機取5處不連續的位置,測量內膜及中膜厚度,計算內膜厚度/中膜厚度,取均值。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料比較用獨立樣本 t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠各時點血清TNF-α水平比較 見表1。

表1 兩組大鼠各時點血清TNF-α水平比較(ng/L,±s)

表1 兩組大鼠各時點血清TNF-α水平比較(ng/L,±s)

注：與對照組相比,＊P＜0.05

TNF-α組別 術前 術后1 d 3 d 7 d對照組 214.84±12.90 202.45±20.59 233.07±20.28 240.70±42.68藥物組 204.35±19.87 208.57±20.09 227.36±29.46 176.18±19.68＊

2.2 兩組大鼠移植靜脈內膜及中膜厚度、內膜厚度/中膜厚度比較 見表2。

3 討論

p38MAPK是MAPK家族成員之一,紫外線、熱休克、滲透壓、牽張、剪切力、缺血再灌注、氧化應激以及IL-1、TNF-α等炎癥因子均可激活細胞的p38MAPK。p38MAPK被磷酸化激活后進入細胞核內或轉移到其他部位,發揮對應激條件下的細胞免疫調節、炎癥反應及對細胞生長、分化、增殖和凋亡過程的調控。因此,p38MAPK被認為是細胞信息傳遞的交匯點或共同通路。

表2 兩組大鼠移植靜脈內膜厚度及內膜厚度/中膜厚度比較(±s)

表2 兩組大鼠移植靜脈內膜厚度及內膜厚度/中膜厚度比較(±s)

注：與對照組相比,＊P＜0.05

組別 n 內膜厚度(μm) 內膜厚度/中膜厚度對照組 13 38.5±1.50 1.70±0.12藥物組 13 33.6±1.34＊ 1.23±0.08＊

冠心病是糖尿病的血管并發癥之一,CABG是其主要的治療方法,大隱靜脈是使用最多的移植血管,但術后第1年即有12%～20%的移植血管發生阻塞,此后每年再有 4%的血管出現阻塞。移植血管發生阻塞的機制可能有以下幾方面：①手術創傷可導致靜脈內皮細胞損傷,使血管內膠原纖維暴露而激活p38MAPK;p38MAPK激活后能產生血栓素,引發血小板聚集,從而導致移植血管閉塞。同時,手術創傷亦可引起炎性細胞因子TNF-α等釋放,也可活化p38MAPK,而活化的p38MAPK又可通過正反饋機制加強TNF-α的表達,從而導致血管內膜的增厚。②糖尿病患者持續的高血糖可直接損壞血管內皮,且血脂異常及游離脂肪酸增加均可導致氧自由基增多,從而激活p38MAPK,促進單核巨噬細胞分泌大量的細胞因子(如TNF-α),參與移植血管內膜的增生;陳惠玲等[5]研究發現,平滑肌細胞接受不同濃度的H2O2刺激可激活p38 MAPK,從而促進平滑肌細胞凋亡,進而參與糖尿病血管并發癥的發生。③糖基化終產物 AGE與細胞表面特異性受體相互作用,是導致糖尿病并發癥的重要原因[6]。RAGE是近年來發現的一種細胞膜受體,主要分布于血管內皮細胞、血管平滑肌細胞及巨噬細胞等細胞表面。RAGE與其AGE結合可引起血管內皮損傷、細胞基質異常增生及血流動力學、血液流變學異常等改變[7～9],其信號傳導是通過 AGE+RAGE→p38MAPK→NF-κB→細胞因子(如TNF-α)通路來實現的[10],進而參與移植血管內膜的增生。王欣等[11]研究發現,自體靜脈移植的糖尿病大鼠血清中的AGE水平與移植血管內膜的增生呈正相關。④糖尿病患者體內的高滲透壓同樣可以激活p38MAPK,從而參與血管內膜的增生、生長及平滑肌細胞的增殖。

本研究顯示,藥物組血管內膜增生較對照組有明顯減輕,TNF-α表達明顯低于對照組。這提示p38MAPK抑制劑CBS3830對移植血管的內膜增生有抑制作用,與其降低 TNF-α表達有關。因此,阻斷或調控MAPK信號轉導途徑的活性,有可能成為防治糖尿病患者CABG后移植血管內膜增生的有效靶點。但糖尿病患者CABG后移植血管的內膜增生是多因素作用的結果,具體機制復雜,有待進一步研究。

[1]鐘學禮.臨床糖尿病學[M].上海：上海科學技術出版社,1995：222.

[2]Herlitz J,Malmberg K.How to improve the cardiac prognosis for diadetes[J].Diebetes Care,1999,22(Suppl 2)：89-96.

[3]劉永志,葛建軍.改良cuff法建立大鼠自體靜脈移植動脈化模型[J].安徽醫藥,2010,14(5)：560-562.

[4]梁曉俐.病理學基礎與實驗技術[M].北京：軍事醫學科學出版社,2004：129-138.

[5]陳慧玲,廖蘭.H2O2對平滑肌細胞凋亡及p38MAPK活性的影響[J].湖南醫科大學學報,2002,27(5)：402-404.

[6]Stern DM,Yan SD,Yan SF,etal.Receptor for advanced glycation end products(RAGE)and the complicationsofdiabetes[J].Aging Res Rev,2002,1(1)：1-15.

[7]Ramasamy R,Vannucci SJ,Yan SS,et al.Advanced glycation end products and RAGE：a common thread in aging,diabetes, neurodegeneration,and inflammation[J].Glycobiology,2005,15 (7)：16-28.

[8]Ramasamy R,Yan SF,Schm idt AM.The RAGE axis and endothelial dysfunction：maladaptive roles in the diabetic vasculature and beyond[J].Trends Cardiovasc Med,2005,15(7)：237-243.

[9]Bierhaus A,Humpert PM,Stern DM,et al.Advanced glycation end product receptor-mediated cellular dysfunction[J].Ann NY Acad Sci,2005,1043(6)：676-680.

[10]Yeh CH,Sturgis L,Haidacher J,et al.Requirement for p38 and p44/p42m itogen-activated protein kinases in RAGE-mediated nuclear factor-kappaB transcriptional activation and cytokine secreti on[J].Diabetes,2001,50(6)：1495-1504.

[11]王欣,張強.糖尿病對大鼠自體移植靜脈內膜增生的影響[J].中國普通外科雜志,2008,17(6)：560-565.