微生物酯酶用于檢測有機磷農藥殘留的研究

黃歡 黃敬洲

【摘 要】文章主要研究利用微生物乙酰膽堿酯酶抑制法開展蔬菜農藥殘留檢測。通過使用超聲波、滲透壓、溶菌酶等方法，從微生物中提取對有機磷農藥敏感的微生物酯酶。根據有機磷農藥能夠抑制膽堿酯酶的機理，用比色法測定酶的活性。結果表明：酶促反應最佳條件是反應時間為15 min、反應溫度為35 ℃、pH值為7.4。選用5種有機磷農藥（敵百蟲、甲胺磷、氧化樂果、乙酰甲胺磷、敵敵畏）對乙酰膽堿酯酶的抑制作用進行了研究。結果表明：農藥濃度在0.1～20 ppm的范圍內，農藥對乙酰膽堿酯酶的抑制率隨濃度的升高而增大。此外，文章還分析了溫度、pH值、金屬離子對該酯酶活力的影響。結果表明：該酯酶在低于40 ℃的條件下穩定，pH值穩定范圍為7.4～8.0；Cu2+有明顯的抑制作用，EDTA有較低的抑制作用，Ca2+、Mg2+、Mn2+則有一定程度的激活作用。

【關鍵詞】有機磷；農藥殘留；微生物酯酶；酶抑制法

【中圖分類號】X839.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2017）06-0068-03

隨著生產的發展，農藥已經成為農業生產十分重要的生產因素，它的廣泛應用為人類創造了巨大的經濟利益，也促進了農業生產的發展。農藥的使用已經在農業生產中成為必然，并且在將來農業的發展依然離不開農藥。但是農藥也會對環境和人類自身造成一定的危害[1]，農藥在食品上的殘留更是引起人們的廣泛關注。農藥殘留量超標，直接影響著人們的身體健康、出口貿易及農民收入的提高，嚴重阻礙了農業的可持續發展。建立一套快速和有效的農藥殘留檢測方法顯得尤為重要，這樣就可以對農藥加以控制，減少和降低農藥對環境和人類的威脅[2]。

為了更有效地建立有機磷及氨基甲酸酯類農藥的檢測方法，本實驗對微生物的膽堿酯酶進行了酶學性質的研究，包括最適反應pH值、最適反應溫度、在不同溫度和不同pH值之下的穩定性、金屬離子對酶活力的影響等。

1 膽堿酯酶的提取

對實驗室包藏菌種進行破胞取酶，用3種方法進行破胞：超聲波、滲透壓和溶菌酶。取3管菌液進行超聲波破胞，超聲波時間分別為2 min、3 min和5 min，再測定破胞后的酶活力，選出最佳超聲波時間。再用4管菌液進行滲透壓破胞，滲透壓的蔗糖濃度分別為15%、20%、25%和30%，再測定破胞后的酶活力，比較出最佳滲透壓濃度。再用4管菌液進行溶菌酶破胞，溶菌酶濃度分別為0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.8 mg/L和1.0 mg/L，測定4管破胞后的酶活力，比較出最佳反應濃度。再通過3種破胞方法的比較，選擇出酶活力最高的實驗條件進行破胞取酶。

2 膽堿酯酶酶活的檢測方法

采用分光光度法：以緩沖液稀釋靛酚乙酸酯（紅色）2.5倍作為底物，乙酰膽堿酯酶將靛酚乙酸酯水解成靛酚（藍色）和乙酸。靛酚在605 nm的可見光處有吸收峰，根據其OD值改變量確定酶的相對活性。

實驗中，在EP管加入10μL膽堿酯酶、450μL緩沖液和50μL靛酚乙酸酯，混勻，于37 ℃水浴中反應20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，取500μL于比色皿中，加入2.5 mL蒸餾水，混勻，測定OD605。

計算公式如下：

膽堿酯酶相對酶活=ΔOD/ΔODmax×100%（1）

公式（1）中：ΔOD為酶反應液OD與對照OD之差；ΔODmax為酶反應液OD與對照OD之差的最大值。

2.1 pH值對膽堿酯酶活力的影響

配制不同pH值的Na2HPO■檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值為4.0～9.0）。在EP管中加入10μL膽堿酯酶、450μL緩沖液和50μL靛酚乙酸酯，混勻。改變緩沖液的pH值，于37 ℃水浴保溫10 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測定OD605。

2.2 溫度對膽堿酯酶活力的影響

在EP管中加入10μL膽堿酯酶、450μL的Na2HPO■檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值為7.6）和50μL靛酚乙酸酯，混勻。在不同溫度（20～50 ℃）的水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測定OD605。

2.3 膽堿酯酶在不同溫度下的穩定性

將10μL膽堿酯酶分別于不同的溫度（20～70 ℃）水浴保溫20 min，加入450μL的Na2HPO■檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值為7.6）和50μL靛酚乙酸酯，混勻，于37 ℃水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測定OD605。

2.4 膽堿酯酶在不同pH值下的穩定性

配制不同pH值的Na2HPO■檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值為4.0～9.0）。將10μL膽堿酯酶分別于不同pH（2.2～9.0）37 ℃水浴保溫20 min，將pH調至7.6，加入50μL靛酚乙酸酯，混勻，于37 ℃水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測定OD605。

2.5 金屬離子對酶活力的影響

加入100μL二價金屬離子溶液于不同的EP管中，加入10μL膽堿酯酶、450μL Tris-HCl緩沖液（5 mmol/L，pH值為8.0）和50μL靛酚乙酸酯，混勻，于37 ℃水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測定OD605，計算金屬離子對膽堿酯酶的抑制率。

抑制率的計算公式如下：

I=（Uo-UI）/Uo×100%（2）

公式（2）中：Uo為未受抑制時膽堿酯酶的活力；UI為受金屬離子抑制時膽堿酯酶的活力。

2.6 不同濃度的農藥對膽堿酯酶活力的影響

用蒸餾水將農藥標樣分別稀釋到一定濃度。取100μL不同濃度的農藥溶液，加入10μL膽堿酯酶，混勻，于37 ℃水浴保溫20 min，再加入450μL的PB（pH值為7.6）和50μL靛酚乙酸酯，混勻，在37 ℃水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測定OD605，計算農藥對膽堿酯酶的抑制率。以農藥濃度為橫坐標，膽堿酯酶的抑制率為縱坐標，繪制不同農藥的抑制曲線。

抑制率的計算公式如下：

I=（Uo-UI）/Uo×100%（3）

公式（3）中：Uo為未受抑制時膽堿酯酶的酶活力；UI為受農藥抑制時膽堿酯酶的酶活力。

3 結果與分析

3.1 膽堿酯酶粗酶活力的測定

使用超聲波、滲透壓和溶菌酶3種方法從微生物中提取膽堿酯酶，并改變各方法的反應條件，再比較所提取的酶活力，選擇最佳的提取條件。

比較3種提取方法，活力最高的為超聲波，使用超聲波2 min提取膽堿脂酶是最佳的選擇。但是，超聲波提取方法提取量低，只適合實驗室提取，如果是大量提取，應該選擇容易操作的滲透壓方法較好。

3.2 pH值對膽堿酯酶活力的影響

酸、堿既能影響酶的穩定性，也能直接影響酶的催化活性。因此，本實驗對酶促反應的最適pH值堿酯酶活力較高，酶活力在80%以上；在45 ℃以后，酶活力顯著下降，剩余酶活在10%以下。

3.4 膽堿酯酶在不同溫度下的穩定性

丁詩華等人[36]報道，不同來源的膽堿酯酶熱穩定性不同，熱穩定性越好則該酶越不易失活，越有利于酶的保存。本實驗將膽堿酯酶在不同溫度（20～45 ℃）水浴保溫20 min，研究其酶活力的變化情況。

膽堿酯酶在20～25 ℃保溫20 min，酶活力基本不變，膽堿酯酶剩余酶活都在80%以上。隨著溫度的升高，酶的活性逐漸降低，在35 ℃保溫20 min，活力下降45%；在40 ℃保溫20 min，活力下降63%；在50 ℃保溫20 min，剩余酶活只有15%，說明膽堿酯酶對熱不穩定，僅在低于25 ℃的條件下穩定。

3.5 膽堿酯酶在不同pH值下的穩定性

酶的活性受酸堿的影響很大，同時酸堿還會影響到顯色反應的程度、顯色時間以及顯色穩定性。本反應是一個酶催化作用下的顯色反應，因此保持酶的活性至關重要，過強的酸堿性對酶的活性都會起到破壞作用。本實驗將膽堿酯酶在不同pH（pH值為4.0～9.0）下保溫20 min，研究其酶活力的變化情況，

膽堿酯酶在pH值為7.4～8.0時，酶活力基本不變，膽堿酯酶剩余酶活都在90%以上；而在pH值為4.0～5.0時，剩余酶活在30%～50%；在pH值為8.6時，活力下降40%；在pH值為9.0時，剩余酶活僅剩42%。這說明膽堿酯酶在不同pH值下的穩定范圍為7.4～8.0。

3.6 金屬離子及EDTA對膽堿酯酶活力的影響

金屬離子對酶的活力有很大的影響。有些金屬離子是穩定酶的三維構象的重要因素；有些金屬離子則是直接參與催化反應的。外加的金屬鹽會改變酶的許多性質，金屬離子對酶的活力影響也有很強的選擇性，起抑制或激活作用。酶液游離的金屬離子也會對膽堿脂酶的活力產生影響，溶液中加入的EDTA會吸收溶液中的游離金屬離子，也會對酶活產生一定的影響。因此，本文研究了幾種常見的金屬離子及EDTA對膽堿酯酶活力的影響。

低濃度的Cu2+、EDTA對膽堿酯酶有明顯的抑制作用，如C（Cu2+）=5 mmol/L時，可以抑制91%左右；C（EDTA）=10 mmol/L時，可以抑制20%左右；Ca2+、Mg2+、Mn2+則對膽堿酯酶有一定程度的激活作用，如C（Mg2+）=5 mmol/L時，可以激活27%左右；C（Ca2+）=5 mmol/L時，可以激活9%左右。

3.7 不同濃度的農藥對膽堿酯酶活力的影響

膽堿酯酶是有機磷藥劑的最適反應底物，其活性能夠專一性地被有機磷和氨基甲酸酯類藥劑所抑制。下面研究了在不同濃度農藥對膽堿酯酶活性的影響。

如圖1所示，農藥對膽堿酯酶的抑制能力隨著濃度的升高，抑制作用增強。其中，敵敵畏對膽堿酯酶的抑制作用靈敏度最高，其濃度在1 ppm后對膽堿酯酶的抑制率在90%以上；而其余農藥在濃度大于10 ppm后對膽堿酯酶的抑制作用基本一致，對膽堿酯酶的抑制率在80%以上。

4 討論

通過實驗發現，膽堿酯酶對敵敵畏、敵百蟲、氧化樂果、甲胺磷、乙酰甲胺磷的敏感性非常高，可用于對有農藥殘留的蔬菜進行檢測。此外，該方法檢測某些蔬菜品種如韭菜、蘿卜、苦瓜時會出現假陽性結果，因為這些蔬菜含有還原劑，會影響靛酚乙酸酯的顯色效果，所以這幾種蔬菜不能用酶抑制法來檢測。同時，該方法檢測農藥殘留還有其他缺陷，如樣品中含有過多的葉綠素、植物次生物質及反應過程中的時間、溫度等均對檢測結果有影響。而且，該方法只能檢測對乙酰膽堿酯酶有抑制作用的有機磷及氨基甲酸酯類農藥，對其他類型農藥造成的污染則無法檢出。

參 考 文 獻

[1]姚建仁，鄭永權，董豐收.淺談農藥殘留污染、中毒與控制策略[J].植物保護，2001，27（3）：31-35.

[2]王晶，陳義珍，張田，等.三種農藥殘留量速測方法的對比性試驗研究[J].中國食品衛生雜志，2001，13（6）：

18-20.

[3]丁詩華，李清漪.赤子愛勝蚓膽堿酯酶的純化和性質[J].

應用與環境生物學報，1997，3（3）：246-251.

[責任編輯：陳澤琦]