草菇鈣調磷酸酶催化亞基（Vv—CNA）的序列與表達

汪健芳 徐志周 嚴俊杰 李肖 張磊 黃李琳 謝寶貴

摘要：【目的】分析草菇鈣調磷酸酶催化亞基（Vv-CNA）的序列與表達，為進一步探究草菇生長發育及子實體開傘分子調控機理提供參考。【方法】通過生物信息學分析確定Vv-CNA基因的組成及保守結構，將ORF Finder預測的草菇CNA氨基酸序列與從NCBI下載的其他真菌CNA氨基酸序列進行比對，并通過熒光定量PCR檢測Vv-CNA基因在草菇不同生長時期的相對表達量。【結果】Vv-CNA基因編碼區為2503 bp，包含10個內含子（其中I2、I8、I9和I10存在內含子保留現象），編碼610個氨基酸，GenBank登錄號KX463514。將Vv-CNA氨基酸序列與動物（人、小鼠）、植物（擬南芥、水稻）和真菌（曲霉、酵母等）的CNA氨基酸序列進行同源比對分析，結果發現Vv-CNA蛋白有3個最保守的結構域，與密褐褶菌（Gloeophyllum trabeum）的親緣關系最近。Vv-CNA基因在草菇子實體的蛋形期和伸長期高表達，以蛋形期的相對表達量最高。【結論】Vv-CNA基因編碼鈣調磷酸酶催化亞基，其高表達有利于草菇菌柄的伸長。

關鍵詞： 草菇；鈣調磷酸酶催化亞基（CNA）；基因結構；表達分析；菌柄伸長

中圖分類號： S646.13 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）03-0381-05

0 引言

【研究意義】草菇（Volvariella volvacea）質嫩味鮮，是我國主栽食用菌之一，在我國南方地區廣泛種植。草菇屬于高溫型食用菌，生長速度快，栽培周期短，播種后一周左右出菇、10 d左右采收。草菇子實體在蛋形期細胞大量增殖與伸長，3～4 h就能使外菌膜破裂而開傘，喪失商品價值（劉學銘等，2011）。分析草菇菌柄伸長（蛋形期和伸長期）特異表達的基因，研究其結構和功能，揭示菌柄伸長的分子機理，對控制草菇開傘具有重要的理論與實踐意義。鈣調磷酸酶（Calcineurin，CN）是受Ca2+/鈣調素（Calmodulin，CaM）直接調節的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，為異源二聚體結構，其組成元件有催化亞基（CNA）和調節亞基（CNB）。CN的催化亞基A（CNA）主要由N-端區域、催化結構域、B亞基結合結構域、鈣調素結合結構域和自抑制區五部分組成，調節亞基B（CNB）是Ca2+結合蛋白EF-hand家族成員之一，B亞基分子上有4個Ca2+結合位點。A亞基與B亞基相結合，才能使CN發揮對生物生長發育的重要調控作用（Herzig and Neumann，2000；Rusnak and Mertz，2000；Ke and Huai，2003）。【前人研究進展】目前關于CN的研究在動物、植物和真菌中均有報道。Molkentin等（1998）發現，在小鼠肥大的心臟肌肉組織中，CN活性及去磷酸化的NFAT（Nuclear factor of activated T cells）含量均大幅度增加，用CN抑制劑處理CN轉基因小鼠，小鼠的平均心臟重量明顯減小，心臟發育趨向正常水平；Parsons等（2004）研究發現，當CNA發生變異時，大鼠慢縮型纖維組織比例明顯下降，用環孢素A抑制CN活性，大鼠骨骼肌出現由慢縮纖維向快縮纖維轉化。Gu等（2008）在研究水稻抗逆性過程中發現，CBL8（Calcineurin B-like protein 8）的上調表達可提高水稻在高鹽環境下的耐受性；Cheong等（2010）的研究結果表明，CBL5（Calcineurin B-like protein 5）在擬南芥中的過量表達可增強其對高鹽和干旱脅迫的耐受性。在真菌方面，Steinbach等（2006）在缺失CNA的煙曲霉突變菌株中發現其菌絲生長量明顯減少，孢子的形成也受到嚴重影響；張世偉（2014）研究表明，在破壞CNA結構的球孢白僵菌中，其細胞壁厚度減小、細胞壁成分發生變化，從而導致細胞壁完整性受到影響。【本研究切入點】現有關于CN的研究主要在動物、植物和真菌上，在食用菌中的研究較少，在草菇上未見相關研究報道。福建農林大學菌物研究中心已完成了草菇基因組和不同生長發育時期表達譜的測序工作，以此為切入點，分析與草菇菌柄生長相關的基因。【擬解決的關鍵問題】通過對草菇基因組和表達譜數據進行分析，找到一個CNA編碼基因，運用相關生物信息學方法確定該基因編碼蛋白的性質與功能，及其在草菇不同生長時期的表達規律，旨在為進一步探究草菇生長發育及子實體開傘分子調控機理提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗草菇菌株H1521由福建主栽品種屏優一號（PY）分離的2個單孢菌株PYd15和PYd21配對雜交獲得。PYd15、PYd21和H1521均由福建省食用菌種質資源保藏與管理中心保藏。

1. 2 基因結構分析

將從Scaffold上預測獲得的基因序列向前、后各延伸3 kb，使用這一序列作為初始參考序列，在Zoom Lite 1.5.4上對轉錄組測序片段進行定位（Morrissy et al.，2009），找到轉錄起始、終止位點和內含子位點及其可變剪接的位置。采用ORF Finder對截獲的cDNA序列進行開放閱讀框區域預測，獲得其編碼的完整氨基酸序列。將獲得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行BLASTp分析，進一步驗證基因同源性（劉朋虎等，2013）。

1. 3 蛋白保守結構域分析

分別從NCBI、UniProt（http：//www.uniprot.org/）數據庫中下載其他物種的CNA氨基酸序列，運用ClustalX進行同源比對分析，預測Vv-CNA的保守結構域。

1. 4 序列比對和系統進化分析

將開放閱讀框讀取的氨基酸序列與從NCBI下載的其他真菌CNA氨基酸序列運用MEGA 5.0（Tamura et al.，2011）的Muscle法進行序列比對，并采用最大似然法進行系統發育進化樹構建，Bootstrap自檢值設為1000。

1. 5 基因表達量檢測

采用E.Z.N.A.TMPlant RNA Kit試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司），分別提取草菇鈕扣期、蛋形期、伸長期和成熟期的菌柄樣品總RNA，采用TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One Step gDNA Removal）試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）反轉錄得到不同時期的cDNA樣品，作為熒光定量PCR的模板。具體程序和步驟參照試劑盒說明書。

根據Zoom定位的內含子位點，用Primer Premier 5.0設計引物，采用草菇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參基因，引物序列見表1。熒光定量PCR反應體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10.0 μL，上、下游引物（0.4 μmol/L）各0.4 μL，模板（cDNA）2.0 μL，ddH2O 7.2 μL，總體積20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環。

1. 6 統計分析

采用2-△△Ct計算目的基因的相對表達量（Livak and Schmittgen，2001），每個樣本重復3次。運用SPSS Statistics.19中的單因素ANOVA分析，進行LSD方差齊性檢驗，對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 基因結構分析結果

通過Zoom Lite 1.5.4進行轉錄組定位，結果顯示，Vv-CNA基因編碼區長度為2503 bp，序列共包含10個內含子，其中4個內含子（I2、I8、I9、I10）存在保留現象（圖1）。通過ORF Finder對Vv-CNA基因的cDNA序列進行閱讀搜索，得到一個長度為1833 bp的完整閱讀框，該閱讀框編碼610個氨基酸。該基因已上傳至NCBI，GenBank登錄號為KX463514。

2. 2 蛋白保守結構域分析結果

將Vv-CNA氨基酸序列與動物（人、小鼠）、植物（擬南芥、水稻）及真菌（曲霉、酵母等）中的CNA氨基酸序列進行同源比對，結果（圖2）表明，Vv-CNA蛋白有3個最保守的結構域，分別為GD（I/V）HG、GDYVDR和GNHE。其中，D、H和N為金屬離子結合位點（用三角號標出），DR和H為活性部位中非常保守的位點（用下劃線標出）（張志新等，2008）。這些保守結構域的存在進一步驗證了Vv-CNA蛋白為鈣調磷酸酶催化亞基的推定。

2. 3 系統進化分析結果

將ORF Finder預測的Vv-CNA氨基酸序列與其他一些真菌CNA氨基酸序列通過序列比對，并構建系統發育進化樹。由圖3可知，Vv-CNA編碼蛋白與毛韌革菌（Stereum hirsutum）、云芝（Trametes versicolor）及密褐褶菌（Gloeophyllum trabeum）等擔子菌屬蛋白聚在同一進化支上，其中與密褐褶菌的親緣關系最近。這些進化樹數據均支持蛋白Vv-CNA為草菇中鈣調磷酸酶催化亞基的推定。

2. 4 Vv-CNA基因在草菇菌柄伸長過程中的差異表達分析結果

針對Vv-CNA基因序列設計引物并進行熒光定量PCR檢測，圖4顯示，與鈕扣期相比，Vv-CNA基因的相對表達量在草菇生長的蛋形期和伸長期呈顯著上調表達（P<0.05），成熟期呈下調表達。由此可推測，CN在草菇菌柄伸長生長過程中發揮一定的作用。

3 討論

CN是參與代謝調控的重要因子，其酶活功能主要由A亞基體現，B亞基起調節作用，B亞基與A亞基緊密地結合時，CN才能發揮其功能（Ke and Huai，2003）。相關研究表明，Ca2+和鈣調蛋白共同調節CN活性，參與細胞活化、增殖、凋亡及對逆境等多種生命活動的調控（Klee et al.，1998；Zhao et al.，1998；Batistic and Kudla，2004；Steinbach et al.，2006）。

本研究首次從草菇基因組中獲得一個鈣調磷酸酶催化亞基編碼基因（Vv-CNA），經相關生物信息學分析，發現Vv-CNA開放閱讀框長度1833 bp，含有4個內含子保留位點，編碼610個氨基酸，CNA蛋白具備CNA最保守的結構域，但與其他物種尚存在一定差異。通過系統進化分析，發現Vv-CNA與密褐褶菌（G. trabeum）相似性最高，通過熒光定量PCR檢測發現Vv-CNA基因在草菇蛋形期和伸長期菌柄呈上調表達，由此可推測該基因與草菇菌柄伸長有關。

張世偉（2014）研究發現，當破壞CNA時，細胞壁變薄，且細胞壁中多糖含量上升，幾丁質含量明顯下降，對細胞壁合成抑制劑剛果紅的敏感性明顯增強。由此表明，CN影響細胞壁的合成及其結構完整性。草菇等大型擔子菌菌柄的伸長主要取決于細胞的伸長生長，而細胞的伸長主要由細胞壁的延伸所引起（Kües and Navarro-González，2015）。由此推測，Vv-CNA基因在蛋形期和伸長期菌柄中的上調表達可提高細胞壁的合成能力，從而促進菌柄細胞的伸長。由Ca2+參與的鈣調信號轉導途徑是真核生物中影響生長過程的重要通路。CN調節途徑是調節Ca2+濃度的關鍵途徑，草菇中CN的發現有利于進一步探究其Ca2+信號轉導途徑的作用機制，但要獲得CN在草菇鈣離子信號通路中的具體作用機制還需進一步研究。

4 結論

Vv-CNA基因在草菇生長的蛋形期和伸長期表達量顯著上調，推測該基因高表達有利于草菇菌柄的伸長。

參考文獻：

劉朋虎，謝寶貴，鄧優錦，江玉姬. 2013. 草菇磷酸果糖激酶（PFK）基因克隆、結構及不同菌株中表達量分析[J]. 菌物學報，32（2）：253-260.

Liu P H，Xie B G，Deng Y J，Jiang Y J. 2013. Cloning，structural analyses and expression levels of phosphofructokinase gene in different strains of Volvariella volvacea[J]. Mycosystema，32（2）：253-260.

劉學銘，廖森泰，陳智毅. 2011. 草菇的化學特性與藥理作用及保鮮與加工研究進展[J]. 食品科學，32（1）：260-264.

Liu X M，Liao S T，Chen Z Y. 2011. Research advance in chemical properties，pharmacological activity of straw mushroom as well as fresh keeping and processing technologies for it[J]. Food Science，32（1）：260-264.

張世偉. 2014. 鈣調磷酸酶催化亞基催化亞基調控球孢白僵菌生長發育、細胞壁結構完整性和毒力[D]. 重慶：西南大學.

Zhang S W. 2014. The catalytic subunit of calcineurin Bbcna regulates growth and development，cell wall integrity and virulence in the insect fungal pathogen Beauveria bassiana[D]. Chongqing：Southwest University.

張志新，徐幼平，曹文淵，蔡新忠. 2008. 一個編碼推定的鈣依賴磷酸酶催化亞基的番茄全長cDNA序列的克隆及其表達分析[J]. 植物病理學報，38（1）：35-43.

Zhang Z X，Xu Y P，Cao W Y，Cai X Z. 2008. Cloning and expression analysis of a tomato full-length cDNA encoding aputative catalytic subunit of calcineurin-like phosphatase[J]. Acta Phytopathologica Sinica，38（1）：35-43.

Batistic O，Kudla J. 2004. Integration and channeling of calcium signaling through the CBL calcium sensor/CIPK protein kinase network[J]. Planta，219（6）：915-924.

Cheong Y H，Sung S J，Kim B G，Pandey G K，Cho J S，Kim K N，Luan S. 2010. Constitutive overexpression of the calcium sensor CBL5 confers osmotic or drought stress tolerance in Arabidopsis[J]. Molecules and Cells，29（2）：159-165.

Gu Z M，Ma B J，Jiang Y，Chen Z W，Su X，Zhang H S. 2008. Expression analysis of the calcineurin B-like gene family in rice（Oryza sativa L.） under environmental stresses[J]. Gene，415（1-2）：1-12.

Herzig S，Neumann J. 2000. Effects of serine/threonine protein phosphatases on ion channelsin excitable membranes[J]. Physiological Reviews，80（1）：173-196.

Ke H M，Huai Q. 2003. Structures of calcineurin and its complexes with immunophilins-immunosuppressants[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，311（4）：1095-1102.

Klee C B，Ren H，Wang X T. 1998. Regulation of the calmo-

dulin-stimulated protein phosphatase，calcineurin[J]. Journal of Biological Chemistry，273（22）：13367-13370.

Kües U，Navarro-González M. 2015. How do agaricomycetes shape their fruiting bodies？ 1. Morphological aspects of development[J]. Fungal Biology Reviews，29（2）：63-97.

Livak K J，Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2[-Delta Delta C（T）] Method[J]. Methods，25（4）：402-408.

Molkentin J D，Lu J R，Antos C L，Markham B，Richardson J，Robbins J，Grant S R，Olson E N. 1998. A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy[J]. Cell，93（2）：215-228.

Morrissy A S，Morin R D，Delaney A，Zeng T，McDonald H，Jones S，Zhao Y J，Hirst M，Marra M A. 2009. Next-generation tag sequencing for cancer gene expression profiling[J]. Genome Research，19（10）：1925-1935.

Parsons S A，Millay D P，Wilkins B J，Bueno O F，Tsika G L，Neilson J R，Liberatore C M，Yutzey K E，Crabtree G R，Tsika R W，Molkentin J D. 2004. Genetic loss of calcineurin blocks mechanical overload-induced skeletal muscle fiber type switching but not hypertrophy[J]. Journal of Biological Chemistry，279（25）：26192-26200.

Rusnak F，Mertz P. 2000. Calcineurin：Form and function[J]. Physiological Reviews，80（4）：1483-1521.

Steinbach W J，Cramer R A，Perfect B Z，Asfaw Y G，Sauer T C，Najvar L K，Kirkpatrick W R，Patterson T F，Jr D K B，Heitman J，Perfect J R. 2006. Calcineurin controls growth，morphology，and pathogenicity in Aspergillus fumigatus[J]. Eukaryotic Cell，5（7）：1091-1103.

Tamura K，Peterson D，Peterson N，Stecher G，Nei M，Kumar S. 2011. MEGA5： Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，28（10）：2731-2739.

Zhao C，Jung U S，Garrett-Engele P，Roe T，Cyert M S，David E L. 1998. Temperature-induced expression of yeast fks2 is under the dual control of protein kinase C and calcineurin[J]. Molecular and Cellular Biology，18（2）：1013-1022.

（責任編輯 羅 麗）