67份柱花草耐鹽性綜合評價

劉一明 馮宇 丁西朋 陳志堅 黃春瓊 董榮書 李欣勇 劉攀道 李園園 白昌軍 劉國道

摘 要 采用水培的方法，在200 mmol/L NaCl脅迫條件下對23個不同種的67份柱花草（Stylosanthes Sw.）進行耐鹽性評價。鹽處理15 d后對枯葉率（WLR）、相對生長量（RG）、葉綠素（Chl）含量和相對含水量（RWC）進行測定。結果表明：柱花草不同種及同一種的不同材料間耐鹽能力存在顯著差異；相關分析表明，WLR與Chl含量、RG及RWC呈顯著負相關，相關系數分別為0.87、0.78及0.59，而FW與Chl含量呈顯著正相關，相關系數達0.72。主成分分析得到2個主成分，可以解釋總變化的89.83%。隸屬函數法耐鹽能力排序及聚類分析表明，直立柱花草CIAT11900、馬弓形柱花草Fine stem、有鉤柱花草CIAT1010、灌木黏質柱花草CIAT11052、弱脈柱花草CIAT11927和有鉤柱花草Verano的耐鹽性最強，有望在濱海鹽漬土的改良中應用。

關鍵詞 柱花草；耐鹽；綜合評價；生理響應

中圖分類號 S541.9 文獻標識碼 A

Abstract In this study， salt tolerance of 67 Stylosanthes Sw. materials belongs to 23 different species were evaluated under 200 mmol/L NaCl stress with hydroponic system. Withered leaf rate（WLR）， relative growth（RG）， chlorophyll（Chl）content and relative water content（RWC）were measured on 15 d of salt treatment. The results showed that there were significant salt tolerance differences among the 67 materials. Correlation analysis showed that WLR was negatively correlated with Chl content， RG and RWC， the correlation coefficients were 0.87， 0.78 and 0.59， respectively， while RG was positively correlated with Chl content， the correlation coefficient was 0.72. PCA showed that two principal components that accounted for 89.83% of the total variance. Membership function and hierarchical cluster analysis showed that S. erecta Beauv. CIAT11900， S. hippocompoide Mohl Fine stem， S. hamata CIAT1010， S. fruticosa Alston CIAT11052， S. debilis Ferr. et Costa CIAT11927 and S. hamata Verano had the best salt tolerance and were expected to be applied on coastal saline soil.

Key words Stylosanthes Sw.； salt tolerance； comprehensive evaluation； physiological response

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.008

生態環境的不斷惡化，不合理的耕作方式繼續延存，致使土壤鹽漬化程度不斷加劇[1]。目前，中國鹽漬土面積約有1億hm2，中國南方地區，特別是四面環海的海南省，由于臺風造成的海水倒灌等原因，數萬公頃的良田不斷受到鹽漬化的危害。對鹽漬土地進行大規模農牧業生產，是人類應對糧食危機的必然選擇[2]。鹽漬土含大量Na+等有害離子，抑制植物的生長發育。鹽脅迫對植物生長主要影響表現在破壞細胞內外的離子和水分的平衡，引起植物代謝失調，同時積累大量活性氧，產生毒害作用，造成膜損傷，最終抑制植物生長，甚至導致死亡[3]。研究植物對鹽分的適應性，篩選耐鹽植物并提高植物的耐鹽性，成為鹽漬土改良開發與利用的重要途徑。

柱花草（Stylosanthes Sw.）又名熱帶苜蓿、巴西苜蓿，為多年生豆科植物，原產于拉丁美洲和加勒比海地區，是全球熱帶及亞熱帶地區廣泛種植的優良豆科牧草[4]。目前在中國華南熱帶、亞熱帶地區大面積種植和推廣，主要用于青飼料、干草粉生產、果園覆蓋、綠肥和水土保持。柱花草在海南、廣東、廣西、福建、云南等5?。▍^）推廣面積達 20多萬 hm2，已成為中國南方熱帶草業的當家草種，形成了中國“北有苜蓿，南有柱花草”的草業產業化發展新格局[5]。柱花草屬約有50個種和變種，常用的栽培種主要有圭亞那柱花草（S. guianensis）、頭狀柱花草（S. capitata）、有鉤柱花草（S. hamata）、灌木柱花草（S. seabrana）、糙柱花草（S. scabra）、矮柱花草（S. humilis）等[6]。柱花草具有高產優質、抗旱、提高土壤肥力等優點。柱花草還是十分高效的固氮植物，改善土壤質地，具有較高的經濟價值[5-6]。

柱花草耐鹽的研究主要集中在種子萌發及幼苗上。謝振宇[7]研究發現低鹽濃度對部分柱花草種子萌發有促進作用，高鹽濃度降低種子萌發率，不同柱花草材料間種子萌發有顯著差異。韓瑞宏[8]研究發現，低鹽濃度對柱花草發芽勢、發芽指數、活力指數及幼苗鮮重有促進作用，高鹽濃度則起抑制作用，且鹽脅迫對幼苗的根、下胚軸影響較大。郇樹亁和吳繁花[9-10]研究也得出了相同的結論，即低鹽濃度促進柱花草種子萌發，高鹽濃度則抑制種子萌發，且不同柱花草間耐鹽能力存在較大差異。以上研究主要集中種子萌發及幼苗的耐鹽研究上，所用材料有限，未對柱花草眾多材料進行系統全面耐鹽鑒定評價。

柱花草種質資源豐富，蘊藏著珍貴多樣的基因庫，因此，通過研究不同材料間耐鹽差異性，挑選優良耐鹽材料及其基因，進而通過基因工程等手段開發和利用這些優良種質資源，培育耐鹽新品種，對提高農業生產力和鹽漬土壤的改良都有十分重要的意義。本研究以67份柱花草為材料，構建柱花草耐鹽評價體系，明確柱花草與耐鹽能力最相關的指標，挖掘耐鹽型柱花草，為進一步研究柱花草的耐鹽生理與分子機制及鹽漬土的改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試柱花草材料共67份（表1），包括從國外引進的種質59份及中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所牧草中心種質資源庫保存的種質8份，其中狹葉柱花草（S. angustifolia Vog.）3份，卡爾奇柱花草（S. calcicola Small）2份，頭狀柱花草（S. capitata）4份，法爾孔柱花草（S. falconensis Calles & Schultze-Kr.）1份，灌木黏質柱花草（S. fruticosa Alston）4份，細莖柱花草（S. gracilis Kunth）1份，大葉柱花草（S. grandifolia M.B.）2份，有鉤柱花草（S. hamata）6份，馬弓形柱花草（S. hippocompoides Mohl）2份，矮柱花草（S. humilis）4份，臭味柱花草（S. ingrate Blake）1份，大頭柱花草（S. macrocephala Ferr. et Costa）3份，糙柱花草（S. scabra）5份，灌木柱花草（S. seabrana）5份，合軸柱花草（S. sympodialis Taub.）1份，黏柱花草（S. viscosa Sw.）3份，弱脈柱花草（S. debilis Ferr. et Costa）1份，直立柱花草（S. erecta Beauv.）1份，光果柱花草（S. leiocarpa Vog.）2份，墨西哥柱花草（S. mexicana Taub.）2份，披毛柱花草（S. pilosa Ferr. et Costa）1份，毛葉柱花草（S. subsericea S.F.Blake）3份，圭亞那柱花草（S. guianensis）10份。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 從中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所資源圃中取各柱花草材料長10 cm的莖段，用海綿包裹后，定植于泡沫板上，將泡沫板漂浮在內裝1/2 Hoagland營養液的長×寬×高分別為110 cm×90 cm×20 cm的塑料培養盆中。定植后，于25～30 ℃，光周期為12 h的溫室內養護管理。當柱花草在溫室內生長2個月后進行鹽脅迫處理，鹽處理濃度為200 mmol/L NaCl。每周換1次營養液，處理后每天用去離子水補充因蒸騰蒸發而損失的水分，使營養液的鹽濃度保持恒定。試驗采用隨機區組設計，3次重復。篩選試驗重復2次，以確保各材料耐鹽能力的可靠性。

1.2.2 指標測定及方法 枯葉率：鹽處理前去除個別枯葉，避免對鹽處理結果造成影響。鹽處理15 d后進行枯葉率統計。枯葉率計算公式為：50%面積出現干枯癥狀的葉片數占總葉片數的百分比[11]。

鮮重：將各柱花草植株從泡沫板上取下，吸水紙吸干表面水分，用天平稱重。本實驗用相對生長量對各材料的耐鹽性進行評價，相對生長量=鹽處理15 d的鮮重/鹽處理0 d的鮮重×100%。

葉綠素含量：用TYS-B葉綠素儀（浙江托普公司）測量葉綠素含量SPAD值。

葉片相對含水量：剪取柱花草葉片約0.2 g，葉片混勻后立即用萬分之一的天平稱其鮮重（Wf）；然后將其浸入裝有去離子水的試管中封口浸泡5 h，稱其飽和重（Wt）；最后在105 ℃的烘箱中殺青30 min，80 ℃烘干24 h后稱其干重（Wd）。計算公式：葉片相對含水量=[（Wf-Wd）/（Wt-Wd）]×100%[12]。

1.2.3 柱花草不同生態型耐鹽能力綜合評價 本實驗用耐鹽指數（salt tolerance trait index，STTI）對柱花草的耐鹽性進行評價，耐鹽指數計算公式為：耐鹽指數（STTI）=處理性狀表現值/對照性狀表現值×100%[13]。

為減少個體間差異引起的實驗誤差，利用所有指標求得的耐鹽指數進行標準化。利用模糊數學中的隸屬函數法對所有柱花草進行綜合評價，其計算公式如下[14]：

X為某種群中某一指標的測定值，Xmin為該種群中某一測定指標的最小值，Xmax為該種群中某一測定指標的最大值。若某一指標與耐鹽能力成正相關，則可用隸屬函數（公式1）計算其隸屬函數值，反之，可用反隸屬函數（公式2）進行計算。最后將各指標的隸屬函數值進行累加求其平均值（公式3），該值越大，表明耐鹽能力越強，反之則耐鹽能力越弱。

1.3 統計分析方法

采用SAS 軟件進行方差分析及最小顯著差異性檢驗（LSD 法）（p<0.05）。用DPS v7.55軟件對所有指標的耐鹽指數進行相關分析、主成分分析（Principal components analysis，PCA）及聚類分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對枯葉率的影響

鹽處理前去除個別枯葉，防止對測定結果造成影響。鹽處理15 d后柱花草對照生長良好，其枯葉率基本為0，因此，本指標只用鹽處理15 d后的枯葉率對各柱花草材料進行評價。鹽脅迫處理15 d后，67份柱花草間枯葉率差異較大，說明柱花草不同材料間耐鹽能力存在明顯差異。其中圭亞那柱花草Schofield（63）、灌木柱花草Primar（42）、直立柱花草CIAT11900（49）、大葉柱花草CIAT1659（17）、大葉柱花草CIAT11856（16）及弱脈柱花草CIAT11927（48）的枯葉率均低于2%，說明這些柱花草材料較耐鹽；而黏柱花草CIAT1011（47）、圭亞那柱花草Endeavour（64）、灌木黏質柱花草CIAT11128（14）、有鉤柱花草CIAT11795（20）、矮柱花草CIAT11751（27）和頭狀柱花草CIAT1019（6）的枯葉率均高于83%，說明這些柱花草材料耐鹽性最差（圖1）。

2.2 鹽脅迫對生長量的影響

鹽處理15 d后，和鹽處理0 d比，不同種柱花草種間生物量（鮮重）有升有降，表明其耐鹽能力有強有弱。圖2對67份柱花草按相對生長量耐鹽指數由高到低進行排列，結果表明，鹽處理15 d后21份柱花草的相對生長量大于100%，表明鹽處理下這些柱花草材料受鹽脅的影響相對較小，其中灌木黏質柱花草CIAT11049（11）、有鉤柱花草CIAT1010（18）、光果柱花草CIAT10095（50）、馬弓形柱花草Fine stem（25）、大葉柱花草CIAT1659（17）和大葉柱花草CIAT11856（16）的相對生長量大于121%。鹽處理15 d后46份柱花草的相對生長量耐鹽指數小于100%，表明這些柱花草材料鹽處理下，生長受到明顯的抑制，灌木黏質柱花草CIAT11128（14）、卡爾奇柱花草CIAT1615（4）、有鉤柱花草CIAT11795（20）、灌木柱花草Unica（43）、矮柱花草CIAT11751（27）和墨西哥柱花草CIAT1590（53）的生物量耐鹽指數小于66%，生長受鹽脅迫的抑制程度最為嚴重。

2.3 鹽脅迫對葉綠素含量的影響

鹽處理對柱花草的葉綠素含量產生了顯著影響，鹽脅迫15 d后，馬弓形柱花草Fine stem（25）、大葉柱花草CIAT11856（16）、有鉤柱花草Verano（23）、圭亞那柱花草Schofield（63）、糙柱花草CIAT11684（35）、直立柱花草CIAT11900（49）和有鉤柱花草CIAT122（21）的葉綠素耐鹽指數均大于63%，表明這些柱花草材料的耐鹽性相對較好，有鉤柱花草CIAT11795（20）、矮柱花草CIAT11751（27）、黏柱花草CIAT1011（47）、灌木黏質柱花草CIAT11058（13）、灌木黏質柱花草CIAT11128（14）和狹葉柱花草CIAT11633（1）的葉綠素耐鹽指數均低于11%，表明這些柱花草材料的耐鹽性相對較差（圖3）。

2.4 鹽脅迫對柱花草相對含水量的影響

鹽脅迫顯著降低了67份柱花草的相對含水量。由圖4可以看出，柱花草間相對含水量耐鹽指數存在顯著差異。糙柱花草CIAT11684（35）、有鉤柱花草CIAT1010（18）、灌木黏質柱花草CIAT11052（12）、弱脈柱花草CIAT11927（48）、直立柱花草CIAT11900（49）和黏柱花草CIAT1346（46）的相對含水量耐鹽指數均在69%以上，而不耐鹽的柱花草有鉤柱花草CIAT11225（19）、灌木黏質柱花草CIAT11128（14）、灌木柱花草Unica（43）、灌木柱花草CIAT2085（41）、墨西哥柱花草CIAT1590（53）和黏柱花草CIAT1011（47）的相對含水量耐鹽指數均低于47%。

2.5 相關分析及主成分分析

相關分析表明，枯葉率與其葉綠素含量、鮮重及相對含水量呈極顯著負相關，相關系數分別為0.87、0.78及0.59。其他指標間都呈極顯著正相關，其中葉綠素含量與鮮重間相關性最高，相關系數為0.72（表2）。

利用各指標的耐鹽指數進行主成分分析，以找出柱花草耐鹽評價的主因子。結果表明，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的百分率分別為73.56%和16.28%，累計百分率達89.83%（表3），其主成分公式如下：

PC1=0.525 5Chl-0.556 8WLR+0.504 4FW+0.399 3RWC

PC2=-0.293 8Chl+0.0847WLR-0.3124FW+0.899 4RWC

2.6 柱花草耐鹽能力綜合評價

利用模糊數學中的隸屬函數法對柱花草各材料的耐鹽能力進行排名，由表4可以看出，柱花草不同種間及種內耐鹽能力差異較大。其中耐鹽能力排名前六的柱花草材料分別為：直立柱花草CIAT11900、馬弓形柱花草Fine stem、有鉤柱花草CIAT1010、灌木黏質柱花草CIAT11052、弱脈柱花草CIAT11927和有鉤柱花草Verano；耐鹽能力排名最差的6份材料為：墨西哥柱花草CIAT1590、矮柱花草CIAT11751、西布拉柱花草Unica、有鉤柱花草CIAT11795、黏質柱花草CIAT1011和灌木黏質柱花草CIAT11128。耐鹽的材料比如直立柱花草CIAT11900、馬弓形柱花草Fine stem、有鉤柱花草CIAT1010、灌木黏質柱花草CIAT11052、弱脈柱花草CIAT11927和有鉤柱花草Verano的枯葉率皆小于15.0%，鮮重耐鹽指數、葉綠素耐鹽指數及相對含水量耐鹽指數分別大于100.2%、52.4%及63.1%；而鹽敏感的墨西哥柱花草CIAT1590、矮柱花草CIAT11751、西布拉柱花草Unica、有鉤柱花草CIAT11795、黏質柱花草CIAT1011和灌木黏質柱花草CIAT11128其枯葉率皆大于70.0%，鮮重耐鹽指數、葉綠素耐鹽指數及相對含水量耐鹽指數分別小于71.4%、21.0%及59.2%。

主成分分析散點圖結果表明，67份柱花草可分為3個不同的群：A，B和C群（圖5）。其中A為鹽敏感材料，B為中等耐鹽材料，C為耐鹽材料。利用各指標的耐鹽指數進行聚類分析，參試的67份柱花草材料在歐氏距離約為36.41處，被分為主要6類：A，B，C，D，E和F類。其中，A和B類主要為耐鹽能力較差的材料，C類為耐鹽能力最差的材料，C類為中等耐鹽，D和F類為耐鹽性較好的材料，E類為耐鹽性中等的材料（圖6）。與PCA散點圖相比，聚類分析更好的區分不同材料間的耐鹽性。

圖7為以耐鹽材料有鉤柱花草CIAT1010和鹽敏感材料有鉤柱花草CIAT11795為代表的表型比較，可以看出，柱花草不同材料間鹽脅迫反應的差異非常明顯。

3 討論

柱花草是中國南方栽培最廣的豆科牧草之一，主要用于禽畜的青飼料供給、果園間作覆蓋及綠肥，在中國南方草業產業中具有非常重要的地位[15]。前期研究表明，柱花草不同種間及同一種的不同材料間種子耐鹽性有較大差異，并且低鹽濃度能促進種子萌發，高鹽濃度則抑制種子萌發[7-8，10，16]。這些研究主要通過發芽率來篩選耐鹽柱花草，但與成熟植株間的耐鹽性差異較大。本研究通過對67份柱花草成熟植株在200 mmol/L NaCl 濃度鹽處理下進行了耐鹽性綜合評價，構建了柱花草耐鹽評價體系，明確柱花草與耐鹽能力最相關的指標，挖掘出耐鹽型與鹽敏感型柱花草，為進一步闡明柱花草耐鹽的生理及分子機制奠定基礎。

枯葉率、鮮重、葉綠素含量及相對含水量等是評價植物耐鹽性強弱的重要指標[17-19]。本研究結果表明，枯葉率、鮮重、葉綠素含量及相對含水量能較好反映柱花草各材料間的耐鹽能力，特別是葉綠素含量與相對含水量，與其他指標間呈極顯著相關，可作為柱花草的耐鹽衡量指標。

植物耐鹽性綜合評價的關鍵是如何對所測指標進行綜合分析。目前常用的方法有主成分分析排名及隸屬函數排名法[20-21]，本實驗用主成分分析獲得衡量柱花草耐鹽評價的兩個主成分，并用隸屬函數法進行排名，分析結果更全面、可靠。

植物不同材料間耐鹽性差異與其遺傳多樣性密切相關[22-23]。柱花草種質資源在全球熱區范圍內均有分布，本試驗所用的67份材料來自南美洲、澳大利亞及中國，遺傳背景豐富。蔣亞君及丁西朋等[6，24]分別對60份和33份柱花草研究發現，柱花草不同材料間其表型和基因型都有較豐富的遺傳多樣性。本實驗結果表明，23個種的67份柱花草材料耐鹽性存在較大差異，這很可能與其豐富的遺傳多樣性有關，推測耐鹽材料可能含有某些特定的耐鹽基因以實現其耐鹽。

植物耐鹽性是由多基因控制的復雜數量性狀[25]。植物主要通過滲透調節、營養元素平衡和增強抗氧化脅迫等途徑實現其耐鹽[26]。研究表明，鹽脅迫下植物的形態會發生相應變化，如葉片變小、根系變發達等[27]；同時，生理生化及代謝方面也發生了相應的防御反應，如體內脫落酸（ABA）等內源激素含量升高，開啟防御體系信號通路[28]；葉表面氣孔開度降低，減小蒸騰速率，降低水分散失[29]；脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等含量升高，調節細胞滲透勢，減少細胞失水[30]；抗氧化酶類活性升高，保護植物細胞膜系統免受氧自由基的傷害等[31]。柱花草耐鹽材料的生理及分子機制目前研究較少，要闡明柱花草的耐鹽機制，后續工作還需對篩選得到的耐鹽材料及鹽敏感材料的光合生理機制、離子轉運及吸收機制、滲透調節機制、活性氧清除機制及鹽脅迫差異表達基因等方面進行深入研究。

本實驗通過對67份柱花草材料的耐鹽性綜合評價，明確柱花草不同種間及同一種的不同材料間耐鹽性存在較大差異。葉綠素含量及相對含水量能較好反映柱花草各材料間的耐鹽能力，可作為柱花草的耐鹽衡量指標。隸屬函數法及聚類分析能有效區分耐鹽型及鹽敏感型柱花草。篩選得到的耐鹽柱花草直立柱花草CIAT11900、馬弓形柱花草Fine stem、有鉤柱花草CIAT1010、灌木黏質柱花草CIAT11052、弱脈柱花草CIAT11927和有鉤柱花草Verano有望在濱海鹽漬土的改良中應用。

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