黃芪多糖抗心肌缺血再灌注損傷的線粒體機(jī)制研究?

范宗靜,謝連娣,董巧稚,崔 杰,劉 洋,吳 旸,逯金金

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院心血管科,北京 100078)

【實(shí)驗(yàn)研究】

黃芪多糖抗心肌缺血再灌注損傷的線粒體機(jī)制研究?

范宗靜,謝連娣,董巧稚,崔 杰,劉 洋,吳 旸△,逯金金

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院心血管科,北京 100078)

目的：通過(guò)觀察黃芪多糖對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌線粒體膜電位、膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)活性及鈣離子濃度等指標(biāo)的影響，以探索黃芪多糖產(chǎn)生心肌保護(hù)作用的線粒體機(jī)制。方法：健康成年SD雄性大鼠35只分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、黃芪多糖預(yù)處理組、黃芪多糖后處理組、陽(yáng)性藥物腺苷對(duì)照組各7只，采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎的方法建立大鼠心肌缺血模型，測(cè)定心肌線粒體膜電位、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)活性、線粒體鈣離子濃度及ROS水平等指標(biāo)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，缺血再灌注損傷組線粒體膜電位、mPTP的開(kāi)放程度、線粒體鈣離子濃度及ROS水平均顯著升高，而經(jīng)黃芪多糖處理后線粒體膜電位、mPTP的開(kāi)放程度、線粒體鈣離子濃度及ROS水平明顯降低。結(jié)論：黃芪多糖可通過(guò)減輕鈣超載，減少ROS 產(chǎn)生，降低膜電位水平及抑制mPTP 過(guò)度開(kāi)放，從而減輕缺血再灌注損傷對(duì)線粒體膜結(jié)構(gòu)的破壞，保護(hù)線粒體功能，進(jìn)而保護(hù)心臟舒縮功能。

心肌缺血再灌注損傷;線粒體;黃芪多糖

心肌缺血再灌注損傷[1](myocardial ischemia reperfusion mjury，MIRI)，是指心肌缺血后在恢復(fù)循環(huán)的早期所出現(xiàn)的較缺血時(shí)更為嚴(yán)重的心肌損害，臨床表現(xiàn)多種多樣，常見(jiàn)的表現(xiàn)為心律失常、血壓驟降、心功能不全甚至猝死等病情加重的現(xiàn)象。MIRI可引起一系列線粒體功能紊亂現(xiàn)象，包括mPTP的開(kāi)放、線粒體基質(zhì)Ca2+超載以及ROS的產(chǎn)生等。中藥在治療 MIRI 方面前景廣闊[2]。黃芪多糖從黃芪中分離萃取，臨床應(yīng)用廣泛，目前其研究具有顯著的心肌保護(hù)作用[3-4]。本研究應(yīng)用最佳作用濃度的黃芪多糖，通過(guò)制作大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，并以心肌線粒體作為研究靶點(diǎn)，觀察黃芪多糖對(duì)心肌線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△Ψm)、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial permeability transitionpore，mPTP)活性等指標(biāo)的作用，從細(xì)胞線粒體層面研究黃芪多糖對(duì)心肌保護(hù)作用的機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康成年SD雄性大鼠35只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001)，體質(zhì)量300～350 g，實(shí)驗(yàn)前大鼠觀察馴養(yǎng)3 d，喂飼普通基礎(chǔ)飼料并保持環(huán)境安靜。

1.2 試劑

5 μmol/L魚(yú)藤酮，5 mmol/L琥珀酸，0.25 mol/L蔗糖，0.1 mol/L Tris-HCl，110 mmol/L KCI，5 mmol/L KH2PO4。HEPES、咪唑、EDTA、CaCl2均購(gòu)自Sigma 公司。

1.3 儀器設(shè)備

Sp-Ⅲ心電監(jiān)護(hù)儀(由美國(guó)COLIN公司提供)，TKR-200C小型動(dòng)物呼吸機(jī)(由江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司提供)，低溫超速離心機(jī)(BECKMEN公司)，電動(dòng)玻璃勻漿器(購(gòu)自寧波新芝科器研究所)，生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)(由北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司提供)，原子吸收分光光度計(jì) (購(gòu)自AA-6601F，島津)，VIS-723分光光度計(jì)(購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司)，電子天平(由梅特勒-托利多儀器有限公司提供)。

2 方法

2.1 缺血再灌注模型的制備

將大鼠麻醉后進(jìn)行氣管插管連接動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)呼吸比2∶1，潮氣量6～8 mL，頻率80次/min，多導(dǎo)聯(lián)心電監(jiān)測(cè)。開(kāi)胸暴露心臟，并找到分離左冠狀動(dòng)脈前降支，以5-0無(wú)創(chuàng)縫合線穿過(guò)血管，阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支血流，心電圖顯示ST段抬高(>0．15 mv)，說(shuō)明結(jié)扎成功；再灌注時(shí)解開(kāi)活結(jié)，即可使阻斷的左冠狀動(dòng)脈前降支血流再通，缺血再灌注模型建立，每次都由同一人完成操作步驟。

2.2 動(dòng)物分組

將35只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組各7只。假手術(shù)組僅于冠狀動(dòng)脈左前降支穿線但不結(jié)扎，并于穿線前和再灌給予等量生理鹽水。缺血再灌注組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，阻斷血流120 min，再灌注60 min，此組不給藥。黃芪多糖預(yù)處理組阻斷血流前立即髂靜脈給予黃芪多糖(30 mg/kg)5 min推入，結(jié)扎120 min后進(jìn)行再灌注，再灌注60 min后給予相應(yīng)容積的生理鹽水。黃芪多糖后處理組阻斷血流前立即給予相應(yīng)容積的生理鹽水，結(jié)扎120 min后進(jìn)行再灌注，并于60 min后給予黃芪多糖(30 mg/kg)5 min推入。陽(yáng)性藥物對(duì)照組阻斷血流前立即經(jīng)髂靜脈給予腺苷(305 μg/kg/min)5 min內(nèi)推入，并于120 min后進(jìn)行再灌注，60 min后給予相應(yīng)容積的生理鹽水。

2.3 大鼠心肌線粒體提取

再灌結(jié)束后剪碎心肌組織，置于7 ml 0.3 mmol/L蔗糖、10 mmol/L咪唑(pH 7.4，4℃)溶液中進(jìn)行研磨，離心10 min后取上清液，再次離心20 min得到少量沉淀物，然后用洗液(成分為25 mmol/L蔗糖，75 mmol/L甘露糖，50 μmol/L EGTA，O.1 mol/L KCI，pH 7.4，4℃)洗1遍，再次離心20 min，沉淀物即為心肌線粒體。并對(duì)線粒體活性及純度進(jìn)行琥珀酸脫氫酶測(cè)定。通過(guò)透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)并進(jìn)行照片分析。

2.4 大鼠線粒體膜電位測(cè)定

取線粒體膜電位測(cè)定反應(yīng)介質(zhì)2 ml并進(jìn)行混勻，測(cè)定熒光值(F1)，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)定為525 nm，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為500 nm；測(cè)試后加入線粒體懸液100 μl進(jìn)行5 min25℃孵育，然后加入100 nmol CaCl2使線粒體腫脹；進(jìn)行5 min離心提取上清，然后測(cè)熒光值(F2)，計(jì)算每毫克線粒體所引起熒光值的變化[(ΔF)=(F1-F2)/(mg prot)]，從而反映線粒體ΔΨm。

2.5 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)活性測(cè)定

先在石英杯中加入反應(yīng)緩沖液2 ml，然后加入濃度0.5 mg/ml的線粒體100 μl，25℃孵育2 min后，加入100 nmol CaCl2誘發(fā)線粒體腫脹。在540 nm波長(zhǎng)下，用分光光度計(jì)測(cè)定加入CaCl2即刻的吸光度值(A0)和10 min時(shí)的吸光度值(A10)，計(jì)算吸光度值的差值(ΔA540=A0-A10)，表示MPTP的活性，以反映線粒體通透性轉(zhuǎn)換的程度。

Ca2+作為常用的mPTP 開(kāi)放誘導(dǎo)劑，用Ca2+進(jìn)行誘導(dǎo)后測(cè)定mPTP 的變化能力，可反映線粒體mPTP 的初始狀態(tài)。將線粒體置于高Ca2+濃度體系中，Ca2+通過(guò)誘導(dǎo)mPTP的開(kāi)放引起線粒體膨脹，使線粒體的吸光度在10 min 內(nèi)逐漸減小。線粒體的吸光度值減少越小，說(shuō)明Ca2+誘導(dǎo)的mPTP 開(kāi)放程度越小，mPTP 的初始狀態(tài)開(kāi)放程度越大。相反，線粒體的吸光度值減少越大，說(shuō)明Ca2+誘導(dǎo)的mPTP 開(kāi)放程度越大，mPTP 的初始狀態(tài)開(kāi)放越少。

2.6 線粒體鈣離子濃度測(cè)定

每組中分別取線粒體懸液1.5 ml置于10 ml的加蓋刻度試管中，然后加入5 ml濃硝酸置于陰暗處硝化1周。烘箱加熱使硝酸分解蒸發(fā)，并加入1%的氯化鑭至10 ml混勻制成樣品。用分光光度計(jì)測(cè)吸收光密度并計(jì)算濃度。

2.7 活性氧簇水平(ROS)測(cè)定

將心肌組織制成單細(xì)胞懸液，再用DMEM培養(yǎng)液懸浮分散細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，觀察到細(xì)胞成片搏動(dòng)后將用于實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞均加入ROS熒光標(biāo)記，空白對(duì)照孔不做任何處理。用PBS清洗細(xì)胞吹打后收集，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。各實(shí)驗(yàn)組分析所用ROS水平為該實(shí)驗(yàn)組流式細(xì)胞儀所測(cè)值減去空白對(duì)照孔的基礎(chǔ)值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組心肌線粒體膜電位比較

表1顯示，經(jīng)測(cè)定反應(yīng)介質(zhì)的熒光值F1=442.48，假手術(shù)組的線粒體熒光值最高，缺血再灌注損傷組的熒光值最低，從而得出線粒體膜電位在假手術(shù)組中最低，在缺血再灌注損傷組中最高。黃芪多糖后處理組和預(yù)處理組線粒體膜電位水平較缺血再灌注損傷組的膜電位均有所減低(P<0.05)。

表1 各組大鼠心肌線粒體膜電位比較

組 別鼠數(shù)F1?F2ΔΨm假手術(shù)組7416 1121 42±3 68缺血再灌注組7399 4343 05±6 63?黃芪多糖預(yù)處理組7410 9031 58±3 84?△黃芪多糖后處理組7407 8638 14±8 00?△腺苷組7409 2743 78±17 00?

注：與假手術(shù)比較：*P<0.05；與缺血再灌注組比較:△P<0.05

3.2 各組大鼠心肌線粒體mPTP活性、心肌細(xì)胞活性氧簇水平(ROS)以及線粒體鈣離子濃度比較

表2顯示，假手術(shù)組mPTP的活性最高，缺血再灌注損傷組mPTP的活性最低，黃芪多糖預(yù)處理組和黃芪多糖后處理組以及腺苷組的mPTP活性均較缺血再灌注損傷組的活性高(P<0.05)，提示黃芪多糖能夠模擬陽(yáng)性藥物腺苷抑制mPTP的開(kāi)放。

表2顯示，假手術(shù)組的鈣離子濃度最低，而缺血再灌注損傷組的鈣離子濃度最高。黃芪多糖預(yù)處理組和后處理組與缺血再灌注損傷組比較，線粒體鈣離子濃度均減低(P<0.05)。黃芪多糖預(yù)處理組的鈣離子濃度低于黃芪多糖后處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2顯示，缺血再灌注損傷與假手術(shù)組比較ROS顯著增高。黃芪多糖預(yù)處理組和后處理組以及腺苷組3組均較缺血再灌注損傷組ROS明顯降低。預(yù)處理組與較后處理組和腺苷組比較，ROS也有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠心肌線粒體mPTP活性比較

注：與假手術(shù)組比較:*P<0.05;與缺血再灌注組比較:△P<0.05;與黃芪多糖后處理組比較:※P<0.01;與黃芪多糖預(yù)處理組比較:#P<0.05

4 討論

黃芪多糖是黃芪的有效活性成分之一，經(jīng)過(guò)高科技多道工藝萃取，目前已證實(shí)其具有心肌保護(hù)作用，然而其心肌保護(hù)的具體細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，尤其是心肌線粒體途徑研究目前還比較少。

線粒體在調(diào)節(jié)活性氧的生成、細(xì)胞凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)中扮演著關(guān)鍵角色，線粒體的完整性對(duì)心肌細(xì)胞存活至關(guān)重要[5]，目前已成為心肌保護(hù)的重要靶點(diǎn)。MIRI能引起線粒體功能障礙，包括心肌能量合成受阻，膜電位的下降、鈣超載、離子穩(wěn)態(tài)失衡及自由基大量產(chǎn)生等。MIRI過(guò)程使線粒體的各種穩(wěn)態(tài)平衡均發(fā)生嚴(yán)重改變，這些因素相互影響并形成惡性循環(huán)，從多種途徑參與MIRI的發(fā)生[6]。

mPTP是線粒體進(jìn)行氧化應(yīng)激、細(xì)胞呼吸、合成ATP等生命活動(dòng)的必要條件，也是影響線粒體穩(wěn)定性和細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素，是MIRI后心肌細(xì)胞損傷的重要原因7-8]。mPTP的持續(xù)開(kāi)放可損傷細(xì)胞線粒體[9-10]，在某些生理情況下mPTP 呈關(guān)閉狀態(tài)，而線粒體內(nèi)膜只是對(duì)某些代謝底物及離子存在選擇性通透。當(dāng)在應(yīng)激時(shí)mPTP 呈開(kāi)放狀態(tài)，會(huì)允許相對(duì)分子質(zhì)量<1500 的小分子通過(guò)，從而導(dǎo)致線粒體質(zhì)滲透壓的升高，而引起線粒體基質(zhì)水腫、外膜損傷、促細(xì)胞凋亡因子及細(xì)胞色素C等釋放。同時(shí)，呼吸鏈與氧化磷酸化解偶聯(lián)，并使線粒體跨膜電位消失，ATP合成停止，致使心肌細(xì)胞的死亡[11]。

當(dāng)缺血再灌注發(fā)生時(shí)，離體心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷。心肌損傷的機(jī)制包括細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化作用、蛋白質(zhì)變性及基因組DNA斷裂。最近有研究結(jié)果表明，△Ψm在MIRI時(shí)異常去極化與ROS的破壞作用同時(shí)發(fā)生[12]，ROS的增加和再灌注后使ΔΨm 快速?gòu)?fù)極化，從而誘發(fā)線粒體內(nèi)膜通透性升高，導(dǎo)致mPTP的持續(xù)開(kāi)放，mPTP的開(kāi)放則會(huì)誘發(fā)細(xì)胞質(zhì)中Ca+大量流入到線粒體內(nèi)，引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致線粒體膜結(jié)構(gòu)受損[13]，引發(fā)線粒體功能障礙。所以，線粒體內(nèi)mPTP開(kāi)放的、Ca+超載與 ROS的損傷互相作用，形成惡性循環(huán)。

本研究顯示，經(jīng)黃芪多糖預(yù)處理或后處理后，mPTP活性均較缺血再灌注損傷組的活性增高，線粒體的膜電位、鈣離子濃度及ROS的釋放均有所減低。進(jìn)而推測(cè)黃芪多糖可以通過(guò)抑制鈣庫(kù)內(nèi)鈣大量釋放減輕鈣超載，從而減輕缺血再灌注對(duì)線粒體呼吸功能的損害。此外，黃芪多糖使ROS產(chǎn)生減少，又進(jìn)一步減輕ROS對(duì)線粒體膜結(jié)構(gòu)的破壞，黃芪多糖抑制mPTP 過(guò)度開(kāi)放，降低線粒體膜興奮性，從而保持線粒體內(nèi)膜完整，保證線粒體ATP合成，保護(hù)線粒體功能并進(jìn)一步改善心肌能量代謝，保護(hù)心臟舒縮功能。

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Astragalus Polysaccharides (APS) Protects Against Myocardial Ischemia-Reperfusion (I/R) Injury Through Mitochondrial Mechanisms

FAN Zong-jing, XIE Lian-di, DONG Qiao-zhi,CUI Jie, LIU Yang, WU Yang△,LU Jin-jin
(DongFangHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China)

Objective: To investigate the mitochondrial mechanisms of Astragalus Polysaccharides (APS) therapy by observing the effects on the expression of the mitochondrial membrane potential (MMP), the active of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) and the concentration of calciumion in rats with myocardial ischemia-reperfusion (I/R) injury. Methods: Thirty five (35) male Sprague-Dauley (SD) rats were randomly divided into the following 5 groups: sham operation group, I/R injury group, APS pre-treatment group, APS post-treatment group and adenosine control group. We measure the levels of MMP, the concentration of calciumion, the level of reactive oxygen species (ROS), andtheactiveofmPTP. Results: Compared with the sham operation group, the I/R injury group showed significantly increase with the levels of MMP, the concentration of calciumion, the level of reactive oxygen species (ROS), andtheactiveofmPTP. Compared with the I/R injury group, the APS pre-treatment group and the APS post-treatment group showed significantly decrease in all these indicators. Conclusion: APS play a protecting role on cardiac function through protecting the function of mitochondria, which byreducingthe levels of ROS,theconcentrationofacalciumion,thelevelofMMP, andinhibitingtheopening ofmPTP.

Myocardial ischemia reperfusion injury(MIRI); Mitochondrium;Astragalus polysaccharides

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81573900)-黃芪多糖對(duì)缺血再灌注損傷人微血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體分裂以及凋亡的影響；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81102573)-黃芪多糖對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌線粒體mPTP開(kāi)放及其調(diào)控因素的影響;北京中醫(yī)藥大學(xué)中青年教師類課題面上項(xiàng)目(2015-JYB-JSMS10)-黃芪多糖后處理對(duì)缺血再灌注損傷人心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mPTP)開(kāi)放等作用的研究

范宗靜(1983-)，女(滿族)，河北承德人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合心血管疾病的防治與研究。

△通訊作者：吳 旸，男，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合心血管疾病的防治與研究，Tel：010-67689756，E-mail：drwuyang@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)04-0484-04

2016-10-17