密蒙花滴眼液對去勢雄兔干眼癥淚腺細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響

彭 俊，歐陽云，2*，譚涵宇，李文娟，吳權龍，彭清華*

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.鹽城市中醫院，江蘇 鹽城 224001）

密蒙花滴眼液對去勢雄兔干眼癥淚腺細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響

彭 俊1，歐陽云1，2*，譚涵宇1，李文娟1，吳權龍1，彭清華1*

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.鹽城市中醫院，江蘇 鹽城 224001）

目的 觀察不同濃度密蒙花滴眼液對去勢雄兔角結膜干燥癥淚腺細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響，并探討其療效。方法 將 42只雄兔隨機分為：空白組（A），模型組（B），密蒙花滴眼液低（C）、中（D）、高（E）濃度組，安慰劑組（F），睪酮組（G），每組6只。除A組外各組切除雙側睪丸及附睪。術后第3天開始C-F組給予滴眼液，3次/d；G組注射丙酸睪酮，每3天1次。各組術前和術后第4周各測量一次SIT和BUT。4周后處死兔子，摘取雙眼淚腺，采用免疫組化法檢測淚腺中TNF-α和IL-1β，并進行統計學分析。結果 （1）SIT與BUT：B、F組前后比較，B組與其他各組及C組與D、E、G組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（2）治療后各組TNF-α、IL-1β比較：B、F組與其他各組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；C組與D、E、G組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（3）TNF-α、IL-1β表達結果：A、G組未見表達；B、F組大量表達于細胞膜和細胞漿中，呈棕黃色顆粒；C、D、E組散見表達。結論 密蒙花滴眼液具有與雄激素相似的抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β表達的作用，但弱于雄激素。密蒙花滴眼液中、高濃度作用無明顯差異，但均較低濃度要優。

干眼癥;密蒙花滴眼液；去勢雄兔；淚腺細胞；炎癥因子

干眼 （dry eye）又稱角結膜干燥癥（keratocon junctivitis sicca），是指任何原因引起的淚液質或量異常，或動力學異常導致的淚膜穩定性下降，并伴有眼部不適和（或）眼表組織病變特征的多種疾病的總稱[1]。干眼為常見眼表病，多為雙眼發病，流行病學及臨床研究發現，其發病率遠較人們想象的要高。我們在前期的臨床及動物實驗中均證實密蒙花對干眼癥具有良好的治療效果[2-8]。本實驗通過將密蒙花生藥制備成密蒙花滴眼液，用于干預去勢雄兔所致雄激素減少性干眼癥動物模型，探討密蒙花滴眼液對雄激素減少所致干眼癥淚腺細胞炎癥因子TNF-α和IL-1β的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用42只健康成年新西蘭長耳白兔，雄性，體質量1.5～2.0 kg，湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物質量許可證號：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2 實驗設備 YZ5H型裂隙燈顯微鏡、YZ11D型直接檢眼鏡均為蘇州六六視覺科技股份有限公司產品；Leica RM2125RTS型石蠟切片機 （德國Leica公司）、B1 Digital數碼顯微鏡 （德國Motic公司）、Image Pro Plus 6.0計算機圖像分析系統 （美國Media Cybernetics公司）等，以上實驗所用相關器材均由由湖南中醫藥大學組織形態學實驗室和眼科實驗室提供。

1.1.3 藥品 丙酸睪酮注射液：天津金耀藥業有限公司（規格：1 mL：25 mg）；注射用青霉素鈉：廣州白云山天心制藥股份有限公司；氯化鈉注射液：江蘇亞邦生緣藥業有限公司（規格：500 mL：4.5 g）；水合氯醛分析純：天津市科密歐化學試劑有限公司；滅菌注射用水：上海長征富民金山制藥有限公司；Schirmer試驗濾紙、熒光素鈉眼科檢測試紙：天津晶明新技術開發有限公司。密蒙花滴眼液及安慰劑滴眼液均由湖南中醫藥大學藥物制劑教研室制備。密蒙花滴眼液規格：低濃度為0.17 g/mL；中濃度為0.33 g/mL；高濃度為0.67 g/mL。安慰劑滴眼液為配制成與密蒙花滴眼液相同顏色及pH值的注射用水。

1.1.4 試劑 Harris蘇木素，伊紅，3%過氧乙酸，羊抗兔TNF-α抗體（規格：200 μg/mL）均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品；兔抗大鼠IL-1β抗體（規格：200 μg/mL）；過氧化物酶標記鏈酶白卵素(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫組織化學試劑盒，3，3-二氨基聯苯胺 （3，3-diaminobenzi dine，DAB）顯色劑均為武漢博士德生物工程有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 按照隨機排列表法分成7組，每組6只兔子。分別為：空白組（A）、模型組（B）、低濃度密蒙花滴眼液組（C簡稱低劑量組）、中濃度密蒙花滴眼液組（D簡稱中劑量組）、高濃度密蒙花滴眼液組（E簡稱高劑量組）、安慰劑滴眼液組（F）、睪酮組（G）。

1.2.2 干眼癥動物模型的建立 除正常對照組外，其余所有兔子均參照相關文獻[9-10]的方法行雙側睪丸及附睪切除術。術后測量模型兔Schirmer I試驗（SIT）和淚膜破裂時間（BUT），當 SIT＜10 mm，BUT＜12 s則造模成功。

1.2.3 術后給藥 除A、B組外，C-F組在術后第3天開始予相應滴眼液1滴滴雙眼，3次/d；G組丙酸睪酮注射液按2 mg/kg行大腿肌肉注射，每3天注射1次。

1.2.4 SIT和BUT測定 各組兔子均于造模前1天和術后第4周行SIT和BUT測定[11]。SIT試驗：按照說明書用法，將濾條按標記線折疊后一端置于下瞼內眥1/3處結膜囊內，另一端垂掛在下瞼外部，輕閉雙眼，5 min后取出濾紙，2 min后觀察并記錄濾紙濕長。BUT測定：將熒光素鈉試紙輕置于下瞼結膜囊內3 s后取出，將裂隙燈顯微鏡調至鈷藍光觀察淚膜破裂時間并記錄。

1.2.5 標本采集及炎癥因子表達觀察 所有兔子在術后常規飼養4周后，采用空氣栓塞法處死，摘取雙眼淚腺，將標本置于4%多聚甲醛中固定24 h后，進行石蠟包埋及切片。

淚腺組織進行免疫組化染色，在200倍光學顯微鏡下觀察各組淚腺細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β染色后情況，拍照并精確選取視野內所有陽性顆粒，采用Image-pro Plus 6.0分析軟件計算出平均光密度值，用于定量表達免疫組化陽性反應程度。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組兔子去勢手術前與治療后SIT值及BUT值比較

模型組和安慰劑組自身前后比較及與空白組比較，SIT與BUT值均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，密蒙花各濃度組和睪酮組SIT與BUT值無明顯降低（P＜0.01）；與密蒙花低濃度組比較，中、高濃度組和睪酮組SIT與BUT值無明顯降低（P＜0.01）；與安慰劑組比較，睪酮組SIT與BUT值無明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組雄兔去勢前與治療后SIT及BUT比較 (±s，n=12)

表1 各組雄兔去勢前與治療后SIT及BUT比較 (±s，n=12)

注：各組自身前后比較，**P＜0.01；治療后與空白組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★★P＜0.01；與低劑量組比較，●●P＜0.01；與安慰劑組比較，◆◆P＜0.01。

組別SIT（mm） BUT（s）術前 術后 術前 術后空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組安慰劑組睪酮組14.75±2.26 14.83±2.04 14.92±2.07 14.75±1.66 14.58±1.51 14.67±1.92 14.83±1.59 14.50±1.45 7.75±1.54**▲▲12.82±1.19★★14.17±1.11★★●●14.17±1.19★★●●7.50±1.62**▲▲●●14.33±1.15★★●●◆◆14.33±2.42 14.42±1.38 14.42±1.51 14.67±1.61 14.25±2.42 14.25±2.42 14.75±2.22 14.08±1.88 6.75±1.66**▲▲12.92±1.08★★14.08±1.24★★●●6.83±1.70★★●●6.83±1.70**▲▲●●14.50±1.24★★●●◆◆

2.2 治療各組雄兔淚腺細胞中TNF-α、IL-1β的表達比較

與空白組比較，模型組和安慰劑組的表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，密蒙花各濃度組和睪酮組的表達無明顯增加（P＜0.01）；與密蒙花低濃度組比較，中、高濃度組和睪酮組的表達無明顯增加（P＜0.05），但安慰劑組明顯增加（P＜0.01）；與安慰劑組比較，睪酮組的表達無明顯增加（P＜0.01）。見表2。

表2 術后各組雄兔淚腺細胞中TNF-α、IL-1β平均光密度值 (±s，n=12)

表2 術后各組雄兔淚腺細胞中TNF-α、IL-1β平均光密度值 (±s，n=12)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與低劑量組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與安慰劑組比較，●●P＜0.01。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組安慰劑組睪酮組TNF-α 0.18±0.10 0.68±0.14** 0.35±0.14▲▲0.24±0.09▲▲★0.24±0.11▲▲★0.65±0.13**★★0.23±0.14▲▲★●●IL-1β 0.24±0.12 0.59±0.17** 0.41±0.16▲▲0.30±0.08▲▲★0.24±0.13▲▲★0.57±0.28**★★0.17±0.11▲▲★●●

2.3 各組TNF-α、IL-1β的表達觀察結果

A、G組：淚腺結構清晰，未見TNF-α、IL-1β表達；B、F組：淚腺結構模糊，TNF-α、IL-1β大量表達于細胞膜和細胞漿中，呈棕黃色顆粒；C、D、E組：淚腺結構清晰，散見TNF-α、IL-1β表達。見圖1-2。

圖1 術后各組TNF-α免疫組化染色光鏡圖（×200倍）

圖2 術后各組IL-1β免疫組化染色光鏡圖（×200倍）

3 討論

2007年國際干眼病專題研究會賦予干眼病的最新定義是：淚液和眼球表面的多因素疾病，能引起患眼不適、視覺障礙和淚膜不穩定，損害眼球表面。該病伴有淚膜滲透性增加和眼表炎癥[12]。與傳統的干眼病定義相比，該定義強調了炎癥在干眼病發病中的重要作用。盡管引起干眼癥的起始病因不同，但一旦進入進展階段，炎癥成為干眼癥發病機制中最關鍵的因素。干眼癥患者淚液和結膜上皮中的多種細胞因子包括IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的水平較正常人有顯著改變，且與干眼癥的嚴重程度相關[13]。

近年研究發現，性激素尤其是雄激素對淚液分泌有著重要的作用。雄激素通過刺激TGF-β的合成，降低淚腺中IL-1β、TNF-α的水平來發揮其免疫抑制的作用，有效地保護淚腺免于炎癥和變性，加速新陳代謝，調控淚腺和瞼板腺的形態及分泌功能。

干眼屬中醫學“白澀癥”范疇，又名“干澀昏花癥”及“神水將枯癥”“神氣枯瘁”。一般認為干眼因肝腎虧損，陰血不足，目失濡養所致。密蒙花味甘，性微寒，歸肝經，具有清熱瀉火養肝、明目退翳之功效，主治目赤翳障、目昏干澀、肝虛目暗、視物昏花等癥[14-15]。現代研究認為密蒙花中的活性成分為黃酮類物質[16]，并且某些黃酮類化合物具有擬雄激素作用[17]，可以用于治療因性激素水平下降所致的某些疾病，如骨質丟失等[18]。

我們對密蒙花的前期實驗研究證實，密蒙花提取物中主要成分為黃酮類，可起到擬雄激素效應，可顯著抑制雄激素水平降低后大鼠干眼癥的發生，抑制淚腺細胞凋亡，維持淚腺基礎分泌量和淚腺的穩定性[2-8]。

目前干眼癥的治療以藥物為主，臨床常用的藥物為人工淚液，該類藥物主要是緩解患者眼部的不適，無法從根本上改變干眼癥的病理狀態。本研究證實密蒙花滴眼液具有類激素效應，能抑制雄激素缺乏所致兔淚腺細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β表達，維持淚腺基礎分泌量和淚腺的穩定性，但其作用弱于雄激素。中、高濃度密蒙花滴眼液對TNF-α和IL-1β的抑制作用要強于低濃度密蒙花滴眼液，但中、高濃度密蒙花滴眼液的抑制作用差別不明顯。本研究既為干眼病的治療提供一種新的天然藥物，又可以避免長期使用雄激素所帶來的副作用，具有廣闊的應用前景。

[1]趙堪興，楊培增.眼科學[M].第7版.北京：人民衛生出版社，2008：77-80.

[2]彭清華，姚小磊，吳權龍，等.密蒙花提取物滴眼對干眼癥去勢鼠淚腺組織雄激素受體數量的影響[J].國際眼科雜志，2010，10(2)：203-208.

[3]吳權龍，彭清華，姚小磊，等.密蒙花提取物滴眼劑對實驗性干眼癥大鼠淚腺組織形態學的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2009，29 (5)：22-25.

[4]姚小磊，彭清華，吳權龍.密蒙花提取物治療兔去勢所致干眼癥[J].眼視光學雜志，2008，l0(1)：21-26.

[5]李懷鳳，彭清華，姚小磊.密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼癥模型角膜和淚腺組織中TNF-α，IL-1β表達的影響[J].國際眼科雜志，2009，9 (7)：1248-1251.

[6]彭清華，姚小磊，彭 俊，等.密蒙花提取物對干眼癥雄兔淚腺局部炎癥反應影響的研究[J].中華中醫藥學刊，2010，28(7)：1351-1356.

[7]陳佳文，彭清華，姚小磊.密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼癥淚腺TGF-β1及其基因表達的影響[J].眼科研究，2010，28(4)：311-314.

[8]姚小磊，彭清華，吳權龍，等.密蒙花提取物對去勢導致干眼癥白兔淚腺細胞凋亡的影響[J].中國中醫眼科雜志，2007，17(3)：139-144.

[9]魏世輝，王志軍.眼科實驗動物學[M].北京：人民軍醫出版社，2010：94.

[10]馬軼群，王傳富，劉美光.去勢雄兔干眼病模型角膜上皮細胞凋亡及相關基因表達的研究[J].眼科研究，2004，22(3)：286-289.

[11]張 梅，陳家祺，劉祖國.干眼癥檢查的進展[J].眼科研究，2001，19（2）：184-187.

[12]Lemp M，Baudouin C，Baum J，et a1.The definition and classification of dry eye disease：report of the definition and classification subcommittee of the international dry eye workshop[J].Ocul Surf，2007，5(2)：75-92.

[13]Pflugfelder SC，Jones D，Ji Z，et a1.Altered cytokine balance in the tear fluid and conjunctiva of patients with sjogrrn’s syndrome keratoconjunctivitis sicca[J].Curr Eye Res，1999，19：201-211.

[14]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：329.

[15]徐國鈞，施大文，沈聯德，等.生藥學[M].北京：人民衛生出版社，1986：313.

[16]韓 澎，崔亞君，郭洪祝，等.密蒙花化學成分及其活性研究[J].中草藥，2004，35(10)：1086-1091.

[17]黃秀蘭，周亞偉，王 偉.淫羊藿黃酮類化合物藥理研究進展[J].中成藥，2005，27(6)：19-781.

[18]Moyad MA.Complementary therapies for reducing the risk of osteoporosis in patients receiving luteinizing hormone-releasing hormone treatment/orchiectomy for prostate cancer： a review and assessment of the need for more research[J].Urology，2002，59(4)：34-40.

（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Butterflybush Flower Eye Drops on Inflammatory Factors TNF-α and IL-1β in Lacrimal Gland Cells of Castrated Male Rabbits with Xerophthalmia

PENG Jun1,OUYANG Yun1,2*,TAN Hanyu1,LI Wenjuan1,WU Quanlong1,PENG Qinghua1*
（1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Yancheng Traditional Chinese Medicine Hospital,Yancheng,Jiangsu 224001,China）

Objective To observe the effects of butterflybush flower eye drops at different concentrations on inflammatory factors TNF-α and IL-1β in lacrimal gland cells of castrated male rabbits with xerophthalmia.Methods The 42 male rabbits were randomly divided into blank group (A),model group (B),low concentrations butterflybush flower eye drops group (C),medium concentrations butterflybush flower eye drops (D),high concentrations butterflybush flower eye drops(E), placebo group (F)and testosterone group (G),six rabbits in each group.All rabbits of group B to G were cut off bilateral testis and epididymis.The rabbits of group C to F were dropped relevant Eye Drops there times a day.The rabbits of group G were injected testosterone propionate injection every 3 days.The SIT and BUT were determined at 4 weeks before and after operation,respectively.After 4 weeks,the lacrimal gland of all rabbits were killed and clipped.The TNF-α and IL-1β in lacrimalgland cellsweretested byimmunohistochemicalstaining method.Results (1)TheSIT and BUT weresignificantly different between group B and F before and after operation (P＜0.01).Compared with other groups,SIT and BUT was significantly different in group B before and after operation (P＜0.01).Compared with group D,E,G,there was significant difference in group C before and after operation (P＜0.01). (2)Comparison of TNF-α and IL-1β after treatment: there was significant difference between group B and F with other groups (P＜0.01).Compared with group D,E,G,the indicators in group C was significantly different(P＜0.05).(3)The expression of TNF-α and IL-1β were not found in group A and G.In group B and F:TNF-α and IL-1β wereexpressed in cellmembraneand cytoplasm heavyly,showing brownish granules with yellow.In group C,D and E,TNF-α and IL-1β were poorly expressed.Conclusion Butterflybush flower eye drops show a similar effect with androgen on depressing the expression of inflammatory factors TNF-α and IL-1β, but its effect is slightly weaker than the androgen.The depressing effect of medium and high concentration buddleia eye drops is better than the low concentration,while there was no significant difference between medium and high concentration.

xerophthalmia;butterflybush flower eye drops;castrated male rabbit;lacrimal gland cell;inflammatory factors

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.05.002

2016-03-23

國家自然科學基金面上資助項目（30772824，81574031）；湖南省高層次衛生人才“225”工程培養項目資助；湖南省科技廳科研基金資助項目（2015SF2016-6）；湖南省發展改革委科研基金資助項目（湘發改投資[2014]658號）；長沙市科技計劃重大專項（K1501014-31）；國家中醫藥管理局中醫眼科學重點學科建設項目。

彭 俊，男，在讀碩士研究生，研究方向：眼表疾病、青光眼及眼底病的中醫藥研究。

*彭清華，男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：pqh410007@126.com；歐陽云，男，博士，主治醫師，E-mail：oyy123@126.com。

本文引用：彭 俊，歐陽云，譚涵宇，李文娟，吳權龍，彭清華.密蒙花滴眼液對去勢雄兔干眼癥淚腺細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017,37(5):469-472.