兩株陽(yáng)性沙門氏菌在樣品中檢出情況分析

摘要：文章對(duì)兩株陽(yáng)性沙門氏菌在樣品中的檢出情況進(jìn)行了分析。模擬自然條件下不同類別樣品沙門氏菌染菌，采用常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行沙門氏菌的檢測(cè)。6份添加雞白痢沙門氏菌ATCC19945樣品有2份檢測(cè)出沙門氏菌，6份添加波恩沙門氏菌CICC21677樣品有6份檢測(cè)出沙門氏菌。

關(guān)鍵詞：雞白痢沙門氏菌；波恩沙門氏菌；沙門氏菌；檢測(cè)技術(shù)；兩株陽(yáng)性沙門氏菌 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R155 文章編號(hào)：1009-2374（2017）08-0098-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.08.047

沙門氏菌（Salmonella）是重要的食源性致病菌之一，已知2500余種沙門氏菌血清型，分屬于46個(gè)O群。沙門氏菌在食品中毒中占有較高比率。據(jù)報(bào)道，2014年沙門氏菌引起的食源性疾病僅次于副溶血性弧菌排第2位。在中國(guó)，由沙門氏菌引起的細(xì)菌性中毒約占中毒事件總數(shù)的70%～80%。由此可以看出，因?yàn)槭称分猩抽T氏菌污染而造成的食源性疾病，是我國(guó)目前食品安全監(jiān)管工作中的一個(gè)重要方面。

目前食品中沙門氏菌國(guó)際國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法仍以常規(guī)培養(yǎng)法為主，此方法需經(jīng)過(guò)預(yù)增菌培養(yǎng)、選擇性增菌培養(yǎng)、劃線分離、生化鑒定、血清分型流程。本研究采用常規(guī)培養(yǎng)法，基于模擬自然狀態(tài)下樣品被沙門氏菌污染的過(guò)程，在不同樣品中分別添加雞白痢沙門氏菌（Salmonella Pullorum）和波恩沙門氏菌（Salmonella Bonn），分析沙門氏菌在樣品中檢出情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株。雞白痢沙門氏菌（ATCC19945）、波恩沙門氏菌（CICCC21677），均保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要儀器。高壓滅菌鍋MLS-3780（日本三洋）、生物安全柜1384（Thermofisher）、水浴鍋DK-600A（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、培養(yǎng)箱DHP-9272（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）

1.1.3 主要試劑。血平板、平板計(jì)數(shù)瓊脂PCA、胰蛋白胨大豆瓊脂TSA、胰蛋白胨大豆肉湯TSB、緩沖蛋白胨水BPW、mKTTn增菌肉湯、RVS增菌肉湯、HE瓊脂、XLD瓊脂（北京陸橋有限公司）、API20E、氧化酶試劑、麥?zhǔn)媳葷峁埽ǚ▏?guó)梅里埃公司）、沙門氏菌A～F血清（寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司）。

1.1.4 食品樣品。

第一，生制品和冷加工食品：雞肉、雞蛋、色拉，雞肉和雞蛋自超市購(gòu)買，色拉自便利店購(gòu)買。

第二，熱加工食品：火腿鴨、蛋糕、盒飯，火腿鴨和蛋糕自超市購(gòu)買，盒飯自便利店購(gòu)買。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理。

第一，生制品和冷加工食品。將雞白痢沙門氏菌ATCC199945在血平板上復(fù)蘇，將波恩沙門氏菌CICC21677在胰蛋白胨大豆瓊脂上復(fù)蘇，自復(fù)蘇平板上挑取單個(gè)菌落均用胰蛋白胨大豆肉湯TSB 37℃培養(yǎng)18h。用平板計(jì)數(shù)瓊脂PCA進(jìn)行計(jì)數(shù)。將上述菌液立即置于5℃冰箱。PCA瓊脂37℃培養(yǎng)24h。

待計(jì)數(shù)結(jié)果出來(lái)后，無(wú)菌稱取25g樣品至均質(zhì)袋中，每個(gè)樣品稱取三份：一份中加入含有約10CFU的雞白痢沙門氏菌ATCC19945的菌懸液；一份中加入含有約10CFU的波恩沙門氏菌CICC21677的菌懸液，混合均勻；一份樣品空白，將雞蛋和色拉置于5℃保存48h。將雞肉置于-18℃保存48h并在加增菌液之前解凍至室溫。

第二，熱加工食品。將雞白痢沙門氏菌ATCC199945在血平板上復(fù)蘇，將波恩沙門氏菌CICC21677在胰蛋白胨大豆瓊脂上復(fù)蘇，自復(fù)蘇平板上挑取單個(gè)菌落均用胰蛋白胨大豆肉湯TSB 37℃培養(yǎng)18h。后將菌液置于50℃水浴鍋中保溫90分鐘。待保溫結(jié)束后，立即將菌液置于5℃冰箱。30分鐘后，用平板計(jì)數(shù)瓊脂PCA進(jìn)行計(jì)數(shù)。將上述菌液立即置于5℃冰箱。PCA瓊脂37℃培養(yǎng)24h。

待計(jì)數(shù)結(jié)果出來(lái)后，無(wú)菌稱取25g樣品至均質(zhì)袋中，每個(gè)樣品稱取三份：一份中加入含有約10CFU經(jīng)加熱處理過(guò)的雞白痢沙門氏菌ATCC19945的菌懸液；一份中加入含有約10CFU經(jīng)加熱處理過(guò)的波恩沙門氏菌CICC21677的菌懸液，混合均勻；一份樣品空白，將樣品置于5℃保存24h。

1.2.2 樣品檢測(cè)。將1.2.1中樣品按照《食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)-沙門氏菌水平檢測(cè)方法》（ISO6579：2002）進(jìn)行檢測(cè)。18份樣品中，除不添加陽(yáng)性菌的雞蛋和色拉以及添加雞白痢沙門氏菌的雞蛋外，其他樣品在選擇性分離平板上均有典型菌落生長(zhǎng)。

1.2.3 生化試驗(yàn)和血清型鑒定。自選擇性分離平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24±3h。用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取培養(yǎng)物，用0.85%NaCl制成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，使用API20E鑒定試劑條進(jìn)行鑒定。結(jié)合API20E和血清學(xué)結(jié)果，判定樣品中是否檢出沙門氏菌。

2 結(jié)果

6份不添加陽(yáng)性菌樣品均未檢出沙門氏菌。添加雞白痢沙門氏菌ATCC19945的樣品中有色拉和蛋糕檢出沙門氏菌，添加波恩沙門氏菌CICC21677的6份樣品有6份檢出沙門氏菌。

3 討論

與預(yù)期目標(biāo)相比，雞白痢沙門氏菌ATCC19945檢出率為33.3%，波恩沙門氏菌CICC21677檢出率為100%。雞白痢沙門氏菌在模擬生制品和冷加工食品以及熱加工食品自然染菌中檢出率都較低，波恩沙門氏菌檢出率都較高，這可能跟不同類型沙門氏菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求有關(guān)系。在菌種復(fù)蘇期間，雞白痢沙門氏菌ATCC19945對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，需在血平板上進(jìn)行復(fù)蘇，在胰蛋白胨大豆瓊脂TSA上復(fù)蘇效果較差。波恩沙門氏菌CICC21677在胰蛋白胨大豆瓊脂上生長(zhǎng)良好。

沙門氏菌是最常見的食源性致病菌之一，目前國(guó)際國(guó)內(nèi)常用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法有GB4789.4-2016、ISO6579-2002、FDA BAM在線第五章，GB 4789.4-2016中，樣品第一步增菌時(shí)pH要求為6.6～7.0，增菌液為緩沖蛋白胨水BPW，ISO6579-2002中，除酸性食品外，對(duì)第一步增菌pH并無(wú)要求，大部分類別樣品增菌液為BPW，對(duì)特定種類食品增菌液提出了要求，F(xiàn)DA BAM在線第五章中，對(duì)大多數(shù)類別樣品第一步增菌pH要求為6.6～7.0，不同類別的樣品增菌液不一樣。沙門氏菌最適生長(zhǎng)pH為6.8～7.8。建議在樣品與增菌液混合均勻后，進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)。李瓊瓊等發(fā)現(xiàn)，BPW前增菌8h沙門氏菌的平板分離效果優(yōu)于前增菌18h。這可能是由于BPW為非選擇性培養(yǎng)基，在對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的同時(shí)也放大了干擾菌的數(shù)量。而當(dāng)干擾菌含量明顯高于目標(biāo)菌時(shí)，這種放大效應(yīng)就更為

明顯。

食品中存在大量雜菌，因此選擇性平板分離培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)目標(biāo)菌和干擾菌的準(zhǔn)確判斷，是整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對(duì)于沙門氏菌分離鑒定的相關(guān)研究通常將弗氏檸檬酸桿菌或奇異變形桿菌作為沙門氏菌檢測(cè)的干擾菌。沙門氏菌常用劃線分離培養(yǎng)基有HE、BS、XLD、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基。BS的選擇性最差，此外，當(dāng)天配制的BS平板，僅在第二天使用有效。銅綠假單胞菌在沙門氏菌的檢測(cè)中存在干擾，在有銅綠假單胞菌干擾的情況下，XLD平板優(yōu)于科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，其中銅綠假單胞菌和沙門氏菌在科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上具有相似的顯色情況。

近年來(lái)，有少量文獻(xiàn)報(bào)道奇異變形桿菌與沙門氏菌具有共同抗原，能夠與沙門氏菌的多價(jià)血清和因子血清發(fā)生交叉凝集，引起菌種鑒定上的困難。沙門氏菌還有一些自凝菌株，方婷子等報(bào)道了一株鑒定為鼠傷寒沙門氏菌的沙門氏菌SJTUF10023在生理鹽水中發(fā)生自凝。

綜上所述，食品中存在大量雜菌，在進(jìn)行預(yù)增菌時(shí)，BPW無(wú)選擇性，不能抑制其他雜菌的生長(zhǎng)，在某些沙門氏菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高的情況下，雜菌可能會(huì)成為競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)菌。沙門氏菌在中性pH時(shí)生長(zhǎng)較為良好，在預(yù)增菌這一步，建議進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)。在劃線分離時(shí)，弗氏檸檬酸菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌等在沙門氏菌劃線分離和生化鑒定存在干擾。在實(shí)際檢測(cè)工作中，應(yīng)考慮到樣品的特性，選擇合適的選擇性液體增菌培養(yǎng)基和選擇性分離平板，在進(jìn)行生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定時(shí)，盡量多挑取一些形態(tài)，以減少樣品中沙門氏菌檢測(cè)的假陰性比率。沙門氏菌檢測(cè)的新方法不斷涌現(xiàn)，免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法日趨成熟，常規(guī)培養(yǎng)法以其成本低等優(yōu)點(diǎn)，在食品微生物檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，常規(guī)培養(yǎng)法存在較大的改進(jìn)空間。本研究采用常規(guī)培養(yǎng)法，模擬自然環(huán)境下模擬自然條件下不同類別樣品沙門氏菌染菌進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)，分析了食品中沙門氏菌檢測(cè)存在的問題，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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作者簡(jiǎn)介：嚴(yán)婷，供職于普研（上海）標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)股份有限公司，上海交通大學(xué)2015級(jí)生物工程在職研究生。

（責(zé)任編輯：王 波）