非小細胞肺癌患者外周血hTERT mRNA水平檢測的臨床意義

周婉婉，梁冰，王效靜，胡丙清

(1.蚌埠醫學院第一附屬醫院 老年病科，安徽 蚌埠 233003； 2.安徽呼吸系病臨床基礎省級實驗室，安徽 蚌埠 233004)

·論 著·

非小細胞肺癌患者外周血hTERT mRNA水平檢測的臨床意義

周婉婉1，梁冰1，王效靜2，胡丙清1

(1.蚌埠醫學院第一附屬醫院 老年病科，安徽 蚌埠 233003； 2.安徽呼吸系病臨床基礎省級實驗室，安徽 蚌埠 233004)

目的：探討非小細胞肺癌(NSCLC)發展與外周血端粒酶逆轉錄酶(hTERT)表達的相關性。方法： 采用Real- time PCR技術檢測114例NSCLC患者和35例肺部良性病變患者外周血hTERT mRNA表達水平，比較二者之間的差異并分析。結果：檢測結果顯示，肺鱗癌Ⅰ～Ⅳ期hTERT mRNA表達量分別為(0.134±0.018)×10-3、(0.185±0.044)×10-3、(0.576±0.267)×10-3、(3.409±2.544)×10-3，Ⅰ、Ⅱ期之間差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組之間差異有統計學意義(P<0.05)；肺腺癌Ⅰ～Ⅳ期hTERT活性分別為(0.156±0.006)×10-3、(0.220±0.052)×10-3、(0.630±0.282)×10-3、(3.230±2.245)×10-3，Ⅰ、Ⅱ期之間差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組之間差異有統計學意義(P<0.05)；同期鱗癌與腺癌之間差異無統計學意義(P>0.05);肺部良性病變組外周血hTERT mRNA表達水平為(0.042±0.017)×10-3，與肺癌組之間存在顯著性差異 (P<0.05)。結論：NSCLC患者外周血hTERT mRNA表達顯著升高，并與NSCLC臨床分期正相關，提示其可作為肺癌診斷和臨床分期的有益參考，但與NSCLC的病理類型無關。

非小細胞肺癌； hTERT mRNA； 實時熒光定量PCR

肺癌是當今世界發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，是男性癌癥死亡的主要原因，也是女性癌癥死亡的第二大原因。國際癌癥研究機構(IARC)估計，每年世界各地有超過1 400 000例患者死于肺癌[1]。其中，非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的85%[2]，但因非小細胞肺癌(NSCLC)的早期癥狀不典型且出現較晚，絕大多數患者在臨床確診時已處在中晚期，晚期 NSCLC 患者比例可達30%～40%[3],總的5年存活率僅為15%[4]。且在經過根治性手術治療的早期NSCLC患者中仍有30%～40%的患者會出現不同程度的復發狀況，并且最終因癌細胞轉移至其他內臟而導致死亡[5]。因此，NSCLC的早期診斷及預后風險的有效評估是攻克癌癥難題中的研究重點，其中作為腫瘤標志物之一的端粒酶則是該研究中的熱點。因此，作者通過對檢測外周血hTERT表達水平在NSCLC中的早期診斷作用進行深入研究，以期為臨床上對NSCLC的診治提供指導。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取蚌埠醫學院第一附屬醫院2015年3月至2016年4月期間呼吸科或心胸外科的住院患者作為研究對象。其中NSCLC組114例，男71例，女43例，平均年齡(58.7±15.0)歲，均經臨床病理明確病理類型，同時根據患者胸部CT、頭顱MRI、骨ECT、腹部彩超等檢查確定臨床分期。病理分型：鱗癌59例，腺癌55例。臨床分期鱗癌Ⅰ期11例、Ⅱ期12例、Ⅲ期21例、Ⅳ15例；腺癌Ⅰ期10例、Ⅱ期11例、Ⅲ期19例、Ⅳ15例。良性肺部疾病組35例,男21例，女14例，平均年齡(62.0±12.2)歲，其中肺炎21例，肺結核5例，胸膜炎2例，炎性假瘤4例，錯構瘤2例，腺瘤1例，均經臨床診斷性治療或病理診斷后明確診斷。

1.2 標本采集

所有疑似肺癌的患者入院后即采集空腹血標本。

1.3 RNA提取

使用淋巴細胞分離液(按照血∶生理鹽水∶淋巴細胞分離液=1∶1 ∶2的比例,1 500r·min-120min離心后獲取淋巴細胞，然后按照TRNzol法提取RNA，采用ThermoDNA/RNA檢測儀檢測RNA的A260nm/A280nm值，經液氮速凍后置-80 ℃冰箱保存。

1.4RNA逆轉錄

根據患者診斷選取合格的標本，用Thermo公司生產的逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。逆轉錄步驟：端粒酶RNA模板1 000ng、Oligo(dT)18primer1μl、RNaseFreedH2O定容值12μl，混勻后短暫離心，置PCR機 65 ℃ 5min后取出放置冰浴速降溫度，然后再次加入5×ReactionBuffer4μl、RibolockRNaseInhibitor1μl、10mmol·L-1dNTPMix2μl、RevertAidM-Mul.VRT1μl，混勻后短暫離心，反轉錄反應條件為42 ℃ 60min、70 ℃ 5min。合成后的cDNA儲存于-80 ℃的冰箱中。

1.5RT-PCR擴增

應用凱基生物的端粒酶熒光定量PCR檢測試劑盒進行擴增，反應體系體積為25μl，包括MaximaSYBRGreenqPCRMasterMix(2×) 12.5μl、引物(試劑盒自帶)上下游各0.5μl、端粒酶DNA模板2μl、無酶水9.5μl。PCR實驗在ABIStepOnePlusPCR儀上執行。循環參數設置：95 ℃ 10min、95 ℃ 15s、60 ℃ 30s、72 ℃ 30s，共40個循環。循環結束后軟件自動分析實驗結果，顯示為擴增曲線和溶解曲線圖以及內參和樣本的CT值。實驗過程采用無酶水作為陰性對照組。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組患者外周血hTERT mRNA的相對表達量

Real- time PCR結果顯示如圖1～4，外周血hTERT mRNA在各實驗組的表達情況如下：鱗癌Ⅰ～Ⅳ期分別為(0.134±0.018)×10-3、(0.185±0.044)×10-3、(0.576±0.267)×10-3、(3.409±2.544)×10-3，Ⅰ、Ⅱ期之間差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組間有顯著差異(P<0.05)；腺癌Ⅰ～Ⅳ期hTERT活性分別為(0.156±0.006)×10-3、(0.220±0.052)×10-3、(0.630±0.282)×10-3、(3.230±2.245)×10-3，Ⅰ、Ⅱ期之間差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組間比較差異顯著(P<0.05)；而同一臨床分期的腺癌與鱗癌組之間差異無統計學意義(P>0.05)；肺部良性病變組為(0.042±0.017)×10-3，與肺癌各組間差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 目的基因擴增曲線Fig 1 Amplification plot of hTERT

圖2 內參擴增曲線Fig 2 Amplification plot of GAPDH

圖3 目的基因溶解曲線Fig 3 Melting curve of hTERT

圖4 內參溶解曲線Fig 4 Melting curve of GAPDH

表1 肺癌患者各臨床病理參數下外周血hTERT mRNA表達情況

Tab 1 Expression of hTERT mRNA in peripheral blood of NSCLC with different clinical pathological parameters

項 目n端粒酶陽性表達情況/例端粒酶活性(×10-3)鱗癌組Ⅰ期114(36．4)0．134±0．018 Ⅱ期125(41．7)0．185±0．044 Ⅲ期2116(76．2)0．576±0．267 Ⅳ期1514(93．3)3．409±2．544腺癌組Ⅰ期103(30)0．156±0．006 Ⅱ期115(45．6)0．220±0．052 Ⅲ期1913(68．4)0．630±0．282 Ⅳ期1513(86．7)3．230±2．245肺部良性病變組353(8．6)0．042±0．017

注:括號中為所占百分比

2.2 Real- time PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

如圖5所示，電泳條帶的大小符合Real- time PCR的結果。其中，NSCLC組患者的hTERT mRNA陽性總表達率為64.0%，肺良性病變組患者的hTERT mRNA陽性表達率為8.6%，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

M.為50 bpDNA梯度;1～4.為肺部良性病變組hTERT mRNA擴增產物;5～12.為非小細胞肺癌組hTERT mRNA擴增產物

圖5 各組hTERT mRNA擴增結果

3 討 論

目前，針對肺癌的相關研究主要是通過在預測肺癌患者有益的方面來探討肺癌的相關生物學特性。在各種癌癥中，端粒酶活性被認為是腫瘤早期診斷、病理程度以及預后的指標。端粒酶主要由人端粒酶RNA(TERC)、具有反轉錄酶活性的人端粒酶逆轉錄酶(TERT)、端粒酶相關蛋白組成[6]，其中TERT是現在研究的熱點。有研究在肺癌組織[7]、胸水[8]中證實肺癌的進展及預后與端粒酶顯著相關。且隨著研究深入，研究者正在通過非侵入性的方式獲得腫瘤標志物，進而能夠及時早期地診斷腫瘤，并在隨訪中對腫瘤進行風險評估。

癌細胞的轉移是臨床肺癌低存活率的主要原因，因此肺癌的早期診斷是降低其病死率的主要措施之一。臨床上，腫瘤細胞轉移的主要方式是血液播散，如果能早期監測到血液循環中的癌細胞,則有可能極大程度地提高腫瘤的診治率。有研究[9]也證實循環血中的生物標志物在腫瘤的診治和預后評估方面具有檢測作用。現已有研究人員在循環血及痰液中檢測到了端粒酶活性[10- 12]。

本實驗檢測了NSCLC患者外周血中hTERT mRNA的表達水平，結果顯示hTERT mRNA在NSCLC患者的外周血中具有較高的表達率，且與TMN分期相關，其中Ⅰ期和Ⅱ期兩者之間差異無統計學意義(P>0.05)，但隨著疾病的進展、惡化，hTERT mRNA表達水平呈顯著性升高(P<0.05)，且NSCLC組患者的hTERT mRNA表達水平明顯高于肺良性病變組(P<0.05)，提示端粒酶在NSCLC的血循環標志方面具有較高的特異性。同時，本實驗結果顯示同一臨床分期的不同類型NSCLC患者的外周血hTERT mRNA的表達差異無統計學意義(P>0.05)，提示端粒酶可能在肺癌的類型診斷方面無明顯意義。同時Ding等[10,13]研究也證實了NSCLC患者外周血hTERT mRNA的表達水平在不同臨床分期中的表達存在著差異，但在病理類型方面無明顯差異。綜上所述，端粒酶的活性表達作為肺癌發生發展過程中的一個重要影響因素，與肺癌的臨床分期呈正相關，因而端粒酶可以作為肺癌患者早期的分子標志物之一，對肺癌的早期診斷具有重要的參考意義。

目前，外周血端粒酶活性的檢測作為一種新的非侵入性的早期檢測手段可廣泛應用于各種腫瘤中，國內外相關研究也展現出了良好的發展前景，但目前大部分相關試驗的樣本數量比較有限，因此，仍需要進一步的大樣本研究。同時在今后的研究中我們還需進一步探討外周血端粒酶活性與腫瘤發展和預后的相關性，并可對其發揮作用的機制進行探討。

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(本文編輯：周蘭波)

The level of hTERT mRNA in peripheral blood of non- small cell lung cancer detected by real- time PCR

ZHOU Wan- wan1,LIANG Bing1,WANG Xiao- jing2,HU Bing- qing1

(1.DepartmentofGeratology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233003,China; 2.ProvincialKeyLabcratoryofRespiratoryDiseaseinAnhui,Bengbu233004,China)

Objective:To discuss the correlation between human telomerase reverse transcriptase (hTERT) activity in peripheral blood and the development of non- small cell lung cancer(NSCLC). Methods: 114 cases of NSCLC and 35 cases of lung benign lesions were collected. hTERT mRNA expression of the patients with NSCLC or lung benign lesions were determined and analyzed by the real- time PCR. Results: The expressions of hTERT mRNA in peripheral blood of Ⅰ- Ⅳ clinical stages of lung squamous carcinoma were (0.134±0.018)×10-3, (0.185±0.044)×10-3,(0.576±0.267)×10-3and (3.409±2.544)×10-3, excepting clinical stage Ⅰand Ⅱ,the differences among other groups were statistically significant(P<0.05); The expressions of hTERT mRNA in peripheral blood of Ⅰ- Ⅳ clinical stages of lung adenocarcinoma were(0.156±0.006)×10-3, (0.220±0.052)×10-3, (0.630±0.282)×10-3, (3.230±2.245)×10-3,excepting clinical stage Ⅰand Ⅱ,the differences among other groups were statistically significant(P<0.05); in the same clinical stage, the differences between squamous carcinoma and adenocarcinoma were not statistically significant(P>0.05). The level of hTERT mRNA in peripheral blood of lung benign lesions was (0.042±0.017)×10-3, and the difference between lung benign lesions and NSCLC was significant (P<0.05). Conclusion: The level of hTERT mRNA of NSCLC increase significantly and it is positively associated with clinical stages, which also implies that the expression of hTERT mRNA may be benefit to make the diagnose and clinical stages of NSCLC, but it is not associated with clinical pathological type.

non- small cell lung cancer； hTERT mRNA； real- time PCR

2016- 08- 02

2016- 12- 11

2014年度安徽省重點實驗室、工程中心(蚌埠醫學院)開放課題(BYKL1413ZD)

周婉婉(1990-)，女，安徽蚌埠人，醫師，醫學碩士。E- mail:1020455575@qq.com

梁冰 E- mail:407281726@qq.com

周婉婉,梁冰,王效靜,等.非小細胞肺癌患者外周血hTERT mRNA水平檢測的臨床意義[J].東南大學學報:醫學版,2017,36(2):217- 221.

R734.2

A

1671- 6264(2017)02- 0217- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.017