可得然膠酸法降解寡糖的HPLC/ESI-MS分析

孫玉姣， 戚歆宇， 張 涵， 侯 令， 陳雪峰

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

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可得然膠酸法降解寡糖的HPLC/ESI-MS分析

孫玉姣， 戚歆宇， 張 涵， 侯 令， 陳雪峰

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

以可得然膠為原料，利用TLC(thin layer chromatography)和HPLC(high performance liquid chromatography)技術對酸降解后獲得的可得然膠寡糖的各組分進行了分離分析， 并結合ESI-MS(electrospray ionization ion-trap mass spectrometry)技術對其結構進行了鑒定.結果表明，酸法可以有效降解可得然膠，獲得結構完整的β-(1→3)-D-葡寡糖.酸降解可獲得聚合度為Dp1～Dp12的葡寡糖，而隨著酸降解時間的延長，單糖和二糖的相對含量明顯升高，而高聚合度葡寡糖(Dp8～Dp12)的相對含量逐漸減少.此外，相比作用于可得然膠多糖使其降解為大片段的寡糖，酸更容易作用于大片段的寡糖使其降解為單糖、二糖和低聚糖.本文可為進一步優化可得然膠的酸法降解以及制備功能性可得然膠寡糖提供理論指導.

可得然膠; 寡糖; 酸降解; 結構鑒定

0 引言

可得然膠(curdlan)是一種天然的直鏈型微生物發酵多糖，由葡萄糖結構單元以β-(1→3)糖苷鍵鏈接而成的葡聚糖，如圖1所示.這種大分子由300～500個葡萄糖殘基組成，其平均聚合度(degree of polymerization，DP)約為450，相對分子量(Molecular weight，Mr)約為74 000 Da，分子式為(C6H10O5)n[1].可得然膠為白色粉末，不溶于水，具有獨特的凝膠特性，是一種常見的食品添加劑，可作為膨脹劑、穩定劑、增稠劑和持水劑等用于肉類、面類、水產類和預制食品等的加工[2].研究發現，可得然膠是一種不被人體消化、不產生熱量的微生物多糖.隨著對可得然膠性質的深入研究，開發可得然膠及其衍生物在醫藥、功能性食品方面的潛能受到了越來越多的關注.

圖1 可得然膠的結構

可得然膠獨特的大分子結構及其特殊的三股螺旋高級立體分子構像，具有抗腫瘤、抗細菌、抗病毒及提高機體的免疫力的生理功能.但可得然膠不溶于水、黏度大的特性，使得其活性低，限制了它的實際應用[3].而將可得然膠降解后得到的寡糖，水溶性增強，生物活性也明顯增強.研究發現，可得然膠可降解產生β-(1→3)-D-葡聚寡糖，且聚合度(DP)為2～10時活性顯著.不僅在動物體內具有較強的免疫調節活性，在植物體內也可作為誘導子激發植物的抗病能力[4-6].

目前，對可得然膠進行降解，常見的降解方法有酶解法、酸降解法和自由基降解法.酶解法雖然條件溫和，但需要專一性的酶，成本較高[7,8].此外，一些非專一性酶如蛋白酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、葡萄糖酶也可作用于可得然膠，但單一酶類作用時降解效率低，往往需要幾種酶類混合作用，不利于其降解機制的研究[9,10].過氧化氫氧化降解法雖能降解可得然膠，得到寡聚糖，但反應的穩定性和重復性較差[11].酸降解法可以有效獲得結構穩定的可得然膠寡糖，且重復性好.然而，可得然膠在酸溶液中產物結構的變化規律以及組分分析的研究較少[12-14].

本文以可得然膠為原料，采用三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)酸水解體系進行降解.通過薄層層析(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)和電噴霧質譜技術(electrospray ionization ion-trap mass spectrometry，ESI-MS)研究產物的降解規律，比較降解前后產物的相對分子質量分布和結構的變化情況，為進一步改進和優化酸水解條件提供理論依據.該研究將為研究寡糖結構和生物活性之間的關系提供物質基礎.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

(1)主要試劑：可得然膠(食品級)，日本武田-麒麟食品公司；麥芽糖糊精(maltodextrin)、3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC)和色譜純乙腈， Sigma 公司；TLC薄層硅膠板(分析型)，德國Macherey-Nagel公司；其余試劑為國產分析純.

(2)主要儀器：Waters Alliance 2487液相色譜-質譜聯用儀，美國Waters公司；RP C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5μm)，安捷倫公司；Thermo Scientific LTQ-XL液相色譜-質譜聯用儀，美國Thermo Scientific公司；Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司.

1.2 可得然膠的TFA降解

經過對已報導的方法[15]進行改進，稱取8.0 g可得然膠，溶解到800 mL的0.1 mol/L三氟乙酸(TFA)中，60 ℃水浴加熱反應.分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、20 h、24 h、36 h和48 h取30 mL樣品置于50 mL離心管中.用氨水將其pH調至中性，除鹽，冷凍干燥，備用.

1.3 可得然膠降解產物的TLC分析

將每個時間點取出的降解產物配制濃度為2 mg/mL，進行TLC分離分析.展開劑是正丁醇∶甲酸∶水=4∶7∶1(v/v/v).分離結束后，將薄層板浸染在地衣酚-濃硫酸顯色液中，在150 ℃下持續加熱，直到所有的條帶顯現出來為止[16].顯色液為0.2 g地衣酚溶于100 mL的甲醇中，加入20 mL的濃硫酸(98%，w/v).

1.4 可得然膠降解產物的HPLC分析

1.4.1 AEC柱前衍生化標記

取5 mg不同時間點制備的降解產物溶于500μL的去離子水中，依次加入200μL的0.2 mol/L AEC溶液(AEC溶解在甲醇)、25μL的0.5 mol/L NaBH3CN溶液和50μL的冰醋酸，混勻后在70 ℃條件下加熱1 h.反應結束后，用1 mol/L NaOH中和，N2吹干.然后加入1 mL二氯甲烷和1 mL蒸餾水對樣品萃取，棄有機相，保留水相，重復三次[17].取水相凍干，配置成5 mg/mL進行HPLC分析.

1.4.2 HPLC分離條件

流動相A:0.01 mol/L 乙酸銨水溶液(pH 4.5)，流動相B:乙腈；梯度洗脫程序：0～60 min，20%(v/v)B～40%(v/v)B；流速為0.5 mL/min.柱溫：40 ℃；紫外檢測器檢測波長：254 nm；進樣量：10μL[18].

1.5 可得然膠降解產物的ESI-MS分析

以N2作載氣，鞘氣(sheath gas)、輔助氣(auxiliary gas)和反吹氣(ion sweep gas)的流速分別為30 arb、5 arb和0 arb；用2μL定樣環進樣，流動相為50%(v/v)甲醇溶液，流速為200μL/min；噴霧電壓(spray voltage)為4 kV；在正離子模式下進行檢測，離子透鏡電壓(tube lens voltage)為250 V；離子傳輸毛細管溫度(capillary temperature)和電壓(capillary voltage)分別為350 ℃和48 V；掃描速度(scan rate)為normal，掃描類型(scan type)為full；質譜范圍(mass range)為m/z200～2 000[19].

2 結果與討論

2.1 可得然膠降解產物的TLC分析

反應0 h的降解產物是無色粘稠狀液體，其余的時間段(2～48 h)的降解產物均為淡黃色澄清液體.對其進行的TLC分析結果如圖2所示.隨著時間的延長，原點處的多糖顯色逐漸變淺，而展開的寡糖顯色逐漸變深，說明多糖含量逐漸減少，寡糖含量逐漸增加，可得然膠被逐步降解為寡糖.

a-l：代表取樣時間點分別為0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、20 h、24 h、36 h和48 h圖2 可得然膠降解產物的TLC分析結果

2.2 可得然膠降解產物的HPLC分析

由于寡糖本身不帶有發色基團，通常需要對其進行柱前衍生使其帶上紫外或熒光基團，提高檢測的靈敏度.因此，采用已建立的3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC)衍生化方法[17]對不同酸解時間得到的可得然膠降解產物進行柱前衍生，然后進行反相HPLC分離.如圖3所示，以葡萄糖和maltodextrin為參考標準，對可得然膠降解產物各組分的保留時間進行分析比較，結果表明可得然膠在酸體系中可得到有效降解.隨著時間的延長，保留時間分別在6.000～10.000 min和小于6.000 min的大片段可得然膠寡糖和未降解可得然膠的峰面積不斷減小，在酸水解12 h時，大片段可得然膠寡糖的峰面積幾乎降為0；而保留時間在11.000～28.000 min的可得然膠各寡糖(Dp1～Dp12)的峰面積變化趨勢更加多樣.

(a)葡萄糖標準

(b)maltodextrin標準

(c)可得然膠降解2 h

(d)可得然膠降解4 h

(e)可得然膠降解6 h

(f)可得然膠降解12 h

(g)可得然膠降解24 h

(h)可得然膠降解48 h圖3 可得然膠降解產物的AEC衍生物的高效液相色譜圖譜

例如，如圖4所示，在酸降解4 h時，可得然膠單糖的相對含量為72.99%，相較于酸降解2 h的9.78%出現了大幅增加；在酸降解4 h時，可得然膠二糖和三糖的相對含量分別為2.11%和1.26%，相較于酸降解2 h的39.95%和9.62%出現了明顯減少；此外，在酸降解4 h時，Dp4～Dp11的相對含量也呈下降趨勢；而在酸降解4 h時，可得然膠十二糖的相對含量為18.95%，相較于酸降解2 h的18.63%出現了小幅增長.這可能是由于購買的可得然膠原材料就含有少量寡糖，使得在酸降解初期TFA不僅作用于多糖，產生十二糖等大分子量寡糖，還作用于原材料包含的寡糖，導致單糖的相對含量明顯增加，且單糖的增幅明顯大于十二糖的增幅.在酸降解6～48 h范圍內，隨著降解時間的延長，可得然膠單糖的相對含量逐漸增加，二糖的相對含量先增加后減少，而分子量較大的寡糖如Dp7～Dp12的相對含量則持續下降.結合酸降解2～4 h和6～48 h的現象，可說明可得然膠的酸水解并不是逐級降級的，而是包含兩個過程，一個過程是將可得然膠多糖降解為大片段的寡糖，另一過程是將大片段的寡糖降解為單糖、二糖和低聚糖，并且這兩個過程是同步、持續進行的，但TFA對寡糖的水解作用更強烈，明顯優于對多糖的水解作用.

根據圖3(c)中各聚合度可得然膠寡糖的峰面積可知，降解2 h時，Dp 1∶Dp 2∶Dp 3∶Dp 4∶Dp 5∶Dp 6∶Dp 7∶Dp 8∶Dp 9∶Dp10∶Dp 11∶Dp 12的比例為1∶4.13∶0.99∶0.42∶0.35∶0.60∶0.50∶0.20∶0.09∶0.07∶0.06∶1.92；根據圖3(d)中各聚合度可得然膠寡糖的峰面積可知，降解4 h時，Dp 1∶Dp 2∶Dp 3∶Dp 4∶Dp 5∶Dp 12的比例為1∶0.03∶0.02∶0.04∶0.02∶0.26；根據圖3(e)中各聚合度可得然膠寡糖的峰面積可知，降解6 h時，Dp 1∶Dp 2∶Dp 3∶Dp 4∶Dp 5∶Dp 6∶Dp 7∶Dp 8∶Dp 9∶Dp10∶Dp 12的比例為1∶8.66∶0.61∶0.25∶0.24∶0.36∶0.31∶0.11∶0.06∶0.11∶1.44；根據圖3(f)中各聚合度可得然膠寡糖的峰面積可知，降解12 h時， Dp 1∶Dp 2∶Dp 3∶Dp 4∶Dp 5∶Dp 6∶Dp 7∶Dp 12為1∶5.92∶0.27∶0.12∶0.11∶0.15∶0.13∶0.28；根據圖3(g)中各聚合度可得然膠寡糖的峰面積可知，降解24 h時，Dp 1∶Dp 2∶Dp 3∶Dp 4∶Dp 5∶Dp 6∶Dp 7∶Dp 8為1∶6.18∶0.37∶0.18∶0.14∶0.17∶0.13∶0.04；根據圖3(h)中各聚合度可得然膠寡糖的峰面積可知，降解48 h時，Dp 1∶Dp 2∶Dp 3∶Dp 4∶Dp 5∶Dp 6∶Dp 7為1∶0.75∶0.06∶0.03∶0.02∶0.03∶0.02.在酸水解6～24 h時，二糖所占的比例最高，分別是66.00%、74.15%和75.09%.當反應時間過長，在酸水解48 h時，產生的單糖含量為52.36%，明顯高于二糖含量(39.50%)，并且寡糖種類也顯著減少，只檢測出了Dp1～Dp7聚合度的寡糖.由此可知，酸水解6～12 h為最佳反應時間.

2.3 可得然膠降解產物的ESI-MS分析

電噴霧質譜(ESI-MS)作為一種軟電離技術，已經被廣泛用于糖類物質的檢測和結構分析中.由圖5可知，以酸降解2 h為例，可得然膠降解產物為一系列的己糖聚糖，含有Dp1～Dp12的成分，每個聚合度的寡糖分子量相差162 Da.結合HPLC分離結果，對ESI-MS圖譜上的各質譜峰進行歸屬，結果見表1所示.各聚合度的分子離子峰多形成與Na+、K+的加成峰.結合高效液相色譜分離和質譜鑒定結果可知，酸法可以有效降解可得然膠，也不破壞寡糖的結構，從而獲得結構完整的可得然膠寡糖，即β-(1→3)-葡寡糖(如圖1所示).

c：酸降解2 h；d：酸降解4 h；e：酸降解6 h；f：酸降解12 h；g：酸降解24 h；h：酸降解48 h圖4 不同酸水解時間獲得的可得然膠各聚合度寡糖相對含量變化的柱狀圖

圖5 可得然膠降解2 h產物的ESI-MS分析圖譜

表1 酸降解獲得的可得然膠寡糖的ESI-MS分析歸屬結果

續表1

保留時間/(min)a聚合度m/z離子寡糖類型所在分離圖譜14.753Dp81337.25[Glc8Na]+八糖圖3(c、e、g)1353.17[Glc8K]+14.034Dp91499.25[Glc9Na]+九糖圖3(c、e)1515.17[Glc9K]+13.374Dp101661.25[Glc10Na]+十糖圖3(c、e)12.750Dp111823.33[Glc11Na]+十一糖圖3(c)12.142Dp121985.42[Glc12Na]+十二糖圖3(c、d、e、f)6.000～10.000大片段可得然膠寡糖圖3(c、d、e)<6.000未降解可得然膠圖3(c、d、e、f、g、h)

a以maltodextrin的高效液相色譜分離保留時間為參考標準.

3 結論

本文以可得然膠為原料，利用HPLC和ESI-MS技術對酸降解后獲得的可得然膠寡糖的各組分進行了分離分析和結構鑒定.結果表明酸法可以有效降解可得然膠，獲得結構完整的β-(1→3)-葡寡糖.此外，可得然膠的酸水解包含兩個過程，一個過程是將可得然膠多糖降解為大片段的寡糖，另一過程是將大片段的寡糖降解為單糖、二糖和低聚糖.

目前研究發現，β-(1→3)-葡寡糖的活性與其聚合度的大小密切相關.例如，從海帶中提取的β-(1→3)-葡寡糖中五糖是誘導植物抗病性的最小基本結構單元，從香菇中提取的β-(1→3)-葡聚糖中六糖具有較強的抗腫瘤活性[5,20,21].

因此，本文通過研究可得然膠的酸降解產物，可為進一步制備和篩選功能性可得然膠寡糖提供理論指導，將為揭示寡糖結構和生物活性之間的關系提供物質基礎.

[1] 張海龍,關志煒,楊俊杰.可得然膠的性質及應用[J].中國食物與營養,2010(1):36-39.

[2] Cai Z,Zhang H. Recent progress on curdlan provided by functionalization strategies[J].Food Hydrocolloids,2017(68):128-135.

[3] 張 琦,張洪斌,叢峰松,等.β-(1→3)-D-葡聚糖可德膠化學改性的研究進展[J].高分子通報,2009(5):20-29.

[4] Hida T H,Ishibashi K,Miura N N,et al.Cytokine induction by a linear 1,3-glucan,curdlan-oligo,in mouse leukocytes in vitro[J].Inflammation Research,2009,58(1):9-14.

[5] Aziz A,Gauthier A,Bezler A,et al.Elicitor and resistance-inducing activities ofβ-1,4-cellodextrins in grapevine,comparison withβ-1,3-glucans and α-1,4-oligogalacturonides[J].Journal of Experimental Botany,2007,58(6):1 463-1 472.

[6] Fu Y,Yin H,Wang W,et al.β-1,3-glucan with different degree of polymerization induced different defense responses in tobacco[J].Carbohydrate Polymers,2011,86(2):774-782.

[7] Fu Y,Cheng L,Meng Y,et al.Cellulosimicrobium cellulans strain E4-5 enzymatic hydrolysis of curdlan for production of (1→3)-linkedβ-D-glucan oligosaccharides[J].Carbohydrate Polymers,2015,134(5):740-744.

[8] Kumgai Y,Okuyama M,Kimura A.Heat treatment of curdlan enhances the enzymatic production of biologically activeβ-(1,3)-glucan oligosaccharides[J].Carbohydrate Polymers,2016,146:396-401.

[9] Chen Y,Zhu Q,Wu S.Preparation and gel properties of low molecular weight curdlan by hydrolysis of curdlan with commercialα-amylase[J].Carbohydrate Polymers,2014,113(113):362-364.

[10] Qian Z,Wu S,Pan S,et al.Preparation of (1→3)-β-D-glucan oligosaccharides by hydrolysis of curdlan with commercialα-amylase[J].Carbohydrate Polymers,2012,87(3):2 362-2 364.

[11] Wu S,Cai R,Sun Y.Degradation of curdlan using hydrogen peroxide[J].Food Chemistry,2012,135(4):2 436-2 438.

[12] 王英杰,蘇 理,蘭文忠,等.水溶性β-1,3-葡聚糖制備及應用研究的進展[J].食品與藥品,2014,16(3):222-226.

[13] 王英杰,趙雙枝,蘇 理,等.水溶性可得然寡糖的制備及其活性研究[J].現代食品科技,2013,29(11):2 735-2 741.

[14] 傅赟彬,劉啟順,李曙光,等.可德蘭寡糖的制備及其組分分析[J].食品科學,2011,32(3):6-9.

[15] Grandpierre C,Janssen H G,Laroche C,et al.Enzymatic and chemical degradation of curdlan targeting the production ofβ-(1→3) oligoglucans[J].Carbohydrate Polymers,2008,71(2):277-286.

[16] Skipski V P,Smolowe A F,Barclay M.Separation of neutral glycosphingolipids and sulfatides by thin-layer chromatography[J].Journal of Lipid Research,1967,8(4):295-299.

[17] 孫玉姣,王承建,耿騰飛,等.κ-卡拉膠寡糖AEC柱前衍生物的LC-ESI-MS/MSn分離分析[J].化學學報,2011,69(14):1 697-1 704.

[18] Sun Y,Liu Y,Jiang K,et al.Electrospray ionization mass spectrometric analysis of κ-carrageenan oligosaccharides obtained by degradation with κ-carrageenase from pedobacter hainanensis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(11):2 398-2 405.

[19] Sun Y,Yang B,Wu Y,et al.Structural characterization and antioxidant activities of κ-carrageenan oligosaccharides degraded by different methods[J].Food Chemistry,2015,178:311-318.

[20] Klarzynski O,Plesse B,Joubert J M,et al.Linearβ-1,3-glucans are elicitors of defense responses in tobacco[J].Plant Physiology,2000,124(3):1 027-1 037.

[21] 張志平,衣悅濤,寧 君.香菇多糖核心片段六糖的合成研究[J].有機化學,2005,25(10):1 240-1 243.

【責任編輯：蔣亞儒】

Analysis on the oligosaccharide products of curdlan from acidic hydrolysis by using HPLC and ESI-MS

SUN Yu-jiao, QI Xin-yu, ZHANG Han, HOU Ling, CHEN Xue-feng

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

In this study,curdlan was subjected to acidic degradation.The oligosaccharide compounds were monitored and separated in detail by thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC),and their structures were identified by electrospray ionization ion-trap mass spectrometry (ESI-MS).The results demonstrated that the hydrolysates were composed ofβ-(1→3)-D-glucan oligosaccharides of Dp1～Dp12 and the structure of oligosaccharides was not changed.The relative proportion of monosaccharide and disaccharide continuously increased,while higher molecular weight fractions (e.g.Dp8～Dp12) gradually decreased during the increase of time course.In addition,acidic hydrolysis would prefer to work on higher molecular weight oligosaccharides to produce monosaccharide,disaccharide and smaller oligosaccharides,than to degrade curdlan polysaccharide to obtain high molecular weight oligosaccharides.This study may be helpful to further optimize acidic hydrolysis condition and control large scale production of functional curdlan oligosaccharides.

curdlan; oligosaccharide; acidic hydrolysis; structural identification

2017-01-07

陜西科技大學博士科研啟動基金項目(BJ16-17); 陜西省科技廳科技統籌創新工程計劃項目(2016KTCL02-32)

孫玉姣(1988-)，女，陜西西安人，講師，博士，研究方向；糖化學與糖生物學

2096-398X(2017)03-0143-05

TS201.2

A