微波輔助提取三葉青多糖工藝優化及其拮抗炎癥細胞的研究

黃有強

華東醫藥股份有限公司藥材參茸分公司 浙江 杭州 310011

微波輔助提取三葉青多糖工藝優化及其拮抗炎癥細胞的研究

黃有強

華東醫藥股份有限公司藥材參茸分公司 浙江 杭州 310011

三葉青多糖 微波 炎癥細胞 實驗研究

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤的塊根或全草，具有清熱解毒、活血祛風等功效。近年來，現代藥理學研究表明其具有抗腫瘤、抗病毒、退高熱等特有的作用，受到國內外研究人員高度的關注[1-3]。多糖是三葉青中的重要組成成分[4]，目前對三葉青多糖的研究表明，其具有抗腫瘤，抗肝損傷，調節免疫的功效[5]，然而尚未見到三葉青多糖抗炎機制研究的相關報道。本文將采用微博輔助法提取三葉青多糖，并對其提取條件進行考察和優化，得到三葉青多糖最佳制備工藝。采用脂多糖（LPS）誘導的炎癥細胞模型，探究三葉青多糖拮抗炎癥細胞的作用并初步闡明其作用機制。

1 材料與儀器

電子天平AE240（瑞士METTLER），微波爐（EM-925FDN-SS，美的集團），HH-S數控恒水浴鍋（金華市文華科教實驗儀器廠），YAMATO低溫旋轉蒸發一體機（日本YAMATO公司），SHIMADZU UV-2450紫外分光光度儀（日本島津公司），VD115真空干燥器（德國賓得）；550型酶標儀(美國Bio-Rad公司)；311型二氧化碳細胞培養箱（Thermo Scientific，USA）。三葉青藥材，產地為浙江，由杭州華東中藥飲片有限公司提供，批號:160121。無水葡萄糖對照品（KAYON公司，批號:20151203）。細胞株:小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞株（中國科學院上海細胞庫提供)，加入10%的胎牛血清、100U/ml青霉素、鏈霉素的高糖DMEM，置于5%CO2，37℃培養箱中生長。細胞生長至70%～80%融合后進行傳代，2～3天傳代1次。LPS(Sigma公司，批號:L2880)，鼠 TNF-α、IL-6 ELIS A檢測試劑盒(美國R&D公司產品)；胎牛血清(美國GIBCO公司產品)；DMEM高糖培養基(美國GIBCO公司)。

2 實驗方法

2.1 三葉青多糖提取工藝考察:三葉青粉末10g，加15倍蒸餾水，置于微波爐內加熱提取后，加無水乙醇，使醇沉濃度達80%，醇沉過夜，獲得三葉青多糖，棄去上清液，離心，沉淀真空干燥，稱重，計算多糖得率及多糖含量。以多糖含量為考察指標，以溶劑量、提取功率、提取時間為考察因素，各設三個水平，作L9(34)正交試驗，見表1。通過正交試驗表統計分析軟件計算試驗結果，確定最佳提取工藝。

表1 因素水平表

2.2 多糖含量測定：分述如下。

2.2.1 標準曲線制備:精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖適量，加水制成0.25mg/ml的對照品溶液。精密吸取梯度濃度的葡萄糖標準液1ml，分別定容至3ml，得系列對照品溶液，各取1ml加入1ml5%苯酚（臨用前現配制）及5ml濃硫酸，100℃水浴30min，取出，放入冰水浴中冷卻15min，以相應的試劑為空白，在490nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2.2 換算因素:精確稱取干燥的三葉青多糖10mg，置于100ml量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。分別精取多糖溶液0.1ml，按照標準曲線制備的方法操作，測定吸收度。另取葡萄糖標準溶液0.25ml，同法操作，求出多糖溶液中的葡萄糖含量，按下式計算換算因素:F=W/C×D，式中:W為多糖的質量，C為多糖溶液中的葡萄糖濃度，D為稀釋倍數。

2.2.3 樣品測定:精密量多糖溶液1ml，置100ml容量瓶中，蒸餾水定容，制成供試品溶液，取1ml至10ml具塞試管中，照1.3標準曲線的制備項下的方法，自精密加入5%苯酚溶液起，依法測定吸光度。從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，按下式計算樣品中多糖的含量:多糖含量（%）＝Cs×D×F×V/W，式中:Cs為供試品溶液中葡萄糖濃度，D為供試品溶液的稀釋因素，F為換算因素，V為供試溶液體積，W為供試品質量。

2.3 三葉青多糖拮抗脂多糖（LPS）誘導炎癥細胞模型作用:三葉青多糖、LPS處理小鼠巨噬細胞用10%的小牛血清培養基調整細胞濃度約為2×106個/ml，分為對照組、模型組、三葉青多糖組。對照組加雙純水(2μg/ml)；模型組加入LPS(2μg/ml)，三葉青多糖組加入LPS (2μg/ml)培養30min后，分別加入濃度100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml的三葉青多糖，陽性對照采用地塞米松（5μg/ml）。各組均在37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24h。收集細胞的上清液，按照試劑盒的說明，檢測標本中腫瘤壞死因子（TNF-α）及白介素-6（IL-6）的水平。

3 結果與分析

3.1 最佳提取工藝優化:采用正交設計實驗，以加水量、提取次數、提取時間為因素，以多糖含量為考察指標。結果見表2。結果表明，最佳提取工藝為:A2B3C3，故最終確定三葉青多糖的提取工藝:加20倍水，500W微波功率下，提取10min。

表2 三葉青多糖提取正交試驗結果

3.2 標準曲線:以葡萄糖對照品濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)進行回歸，得回歸方程:y=8.579x+ 0.007，r=0.9995。結果 表 明多 糖 在 0.09mg/ml～0.125mg/ml之間有良好的線性關系。換算因素:根據計算公式F=W/C×D，式中:W為多糖的質量，C為多糖溶液中的葡萄糖濃度，D為稀釋倍數。測得F=1.701。

3.3 三葉青多糖抑制細胞死亡及對TNF-α、IL-6的影響：分述如下。

3.3.1 三葉青多糖對RAW264.7巨噬細胞活性的影響:培養24h后，模型組RAW 264.7巨噬細胞只有很少的細胞染成紅色，形狀多為圓形，說明RAW 264.7巨噬細胞生長少，且大量死亡，表明LPS誘導RAW 264.7巨噬細胞衰老死亡。三葉青多糖組，隨著三葉青多糖濃度的增加，RAW 264.7巨噬細胞被染成紅色且貼壁生長，形狀呈不規則菱形的巨噬細胞數量越來越多，說明三葉青多糖可以抑制LPS誘導的細胞死亡，并促進細胞生長。

3.3.2 三葉青多糖對LPS誘導后巨噬細胞TNF-α以及IL-6的影響:模型組巨噬細胞經過LPS誘導產生的TNF-α以及IL-6含量明顯高于空白組(P＜0.01)，三葉青多糖組中，隨著濃度增加，對LPS致巨噬細胞產生TNF-α及IL-6的抑制更加明顯。見表3。

表3 各組巨噬細胞TNF-α以及IL-6的含量（±s，ng/L）

表3 各組巨噬細胞TNF-α以及IL-6的含量（±s，ng/L）

注:與模型組比較，*P＜0.01。

組別空白組模型組地塞米松組（5μg/mL）三葉青多糖組（100μg/mL）三葉青多糖組（50μg/mL）三葉青多糖組（25μg/mL）TNF-α 30.28± 8.32*302.36±30.32 152.54±26.66*IL-6 21.00± 6.33*408.69±18.52 182.98±15.09*189.30±21.00*185.67±10.65*241.74±25.33*195.36±11.44*265.58±30.45*222.98±15.32*

4 討論

三葉青多糖是三葉青中含量較高的活性成分，傳統的多糖提取工藝均采用煎煮方法，會導致多糖部分水解，而微波輔助法提取多糖可以縮短實驗和生產時間，同時還可以提高提取率及產品純度并且節省溶劑[6]。本實驗通微波法對三葉青多糖進行提取，通過正交試驗優選出最佳提取工藝，得到多糖的率為14.36%，與傳統方法相比縮短提取時間，提高提取效率。

三葉青具有抗炎、鎮痛、解熱等作用。本研究表明，三葉青多糖對于脂多糖誘導的巨噬細胞死亡有明顯的抑制作用，且巨噬細胞中的炎性因子TNF-α、IL-6的含量較模型組明顯降低，呈現一定的量效應關系。實驗結果顯示，三葉青多糖最佳給藥劑量為20μg/ml～100μg/ml，同時為三葉青多糖用于脂多糖誘導的巨噬細胞和其他細胞衰老死亡提供了有價值的實驗依據。

[1]楊雄志.中藥三葉青的藥理作用與臨床應用[J].吉林中醫藥，2009，29(6):517-518.

[2]鐘良瑞，林霜，魏克民.三葉青黃酮抗肺癌作用研究[J].中國藥理學通報，2016，32(4):480-483.

[3]程權，傅華洲.三葉青藥理作用及臨床應用研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2016，18(4):236-238.

[4]饒君鳳，呂偉德，倪承珠，等.離子色譜法測定三葉青多糖中單糖組成[J].亞太傳統醫藥，2016，12(12):42-44.

[5]林婧，紀明妹，黃澤豪，等.三葉青的化學成分及其體外抗腫瘤活性研究[J].中國藥學雜志，2015，50(8):658-663.

[6]呂佳妮，陳素紅，徐娟華.鐵皮石斛根中石斛多糖的響應面法提取優化研究[J].浙江中醫雜志，2014，49(6):459-461.

2016-09-21