洋金花果皮中生物堿成分及抗腫瘤活性研究

楊炳友，周永強，劉艷，匡海學

(黑龍江中醫藥大學北藥基礎與應用研究教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

洋金花果皮中生物堿成分及抗腫瘤活性研究

楊炳友，周永強，劉艷，匡海學*

(黑龍江中醫藥大學北藥基礎與應用研究教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究洋金花果皮中生物堿成分及抗腫瘤活性。方法：采用硅膠、Sephadex-LH20及HPLC等色譜方法對化合物進行分離和純化，并利用1H-NMR、13C-NMR及MS波譜方法鑒定化合物的結構，以肝癌HepG-2、肺癌A549及胃癌SGC-7901腫瘤細胞為受試細胞，采用MTT法評價化合物的抗腫瘤活性。結果：該研究從洋金花果皮70%乙醇回流提取物的乙酸乙酯部位中共分離得到10個生物堿類化合物，分別鑒定為cyclo(PheTyr)(1)、9-hydroxycanthin-6-one(2)、(2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid(3)、1-ribityl-2,3-diketo-1, 2,3,4-tetrahydro-6,7-dimethyl-quinoxaline(4)、grossamide(5)、cannabisin F(6)、hyoscyamine(7)、trans-N-p-coumaroyl tyramine(8)、N-trans-feruloyloctopamine(9)和(2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide(10)；體外抗腫瘤實驗表明,1～10號化合物均具有潛在腫瘤細胞抑制活性。結論：化合物1～4首次從茄科植物中分離得到，且化合物1、2、5、6和8表現為較強的抗腫瘤活性。

茄科；果皮；生物堿；洋金花；抗腫瘤活性

洋金花為茄科植物白曼陀羅(DaturametelL.)，其蒴果圓球形，表面有疏短刺，成熟后淡褐色[1]。洋金花的藥用歷史悠久，2015版《中國藥典》記載其性味辛、溫，有小毒；具平喘止咳、鎮痛解痙、麻醉之功效[2-5]。目前從洋金花中分離的生物堿主要為東莨菪堿、莨菪堿、曼陀羅堿及阿樸東莨菪堿等莨菪烷類生物堿[6]。這些化學成分通常具有抗菌、抗炎和抗腫瘤等活性。然而，關于洋金花果皮中生物堿成分的文獻鮮有報道。因此，為了深入探討洋金花果皮中的化學成分、尋找其多種生物活性的藥效物質基礎，本文對洋金花果皮的乙酸乙酯萃取部位化學成分深入研究，共分離鑒定了10個生物堿。

1 儀器與材料

2695-2996型分析HPLC(美國Waters公司)；Shimadzu，LC-6AD型制備HPLC(日本島津)；SunFireC18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Waters公司)；SunFireC18色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm，美國Waters公司)；Bruker-400超導核磁共振光譜儀(德國Bruker公司)；Acquity Ultra Performance LCTM液質聯用色譜儀(美國Waters公司)；ELx800酶標儀(美國BioTek公司)；150i型二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；色譜用硅膠(青島海洋化工廠)；Sephadex-LH20(GE Healthcare公司)；提取分離用試劑均為分析純；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMEM(Sigma公司)；10 000 U/mL青霉素/鏈霉素(美國Corning公司)；噻唑藍(MTT Biotopped公司)；DMSO(Sigma公司)；紫杉醇(Sigma公司)；96孔板(美國Corning公司)。

實驗所用的肝癌HepG-2、肺癌A549及胃癌SGC-7901細胞株均購于中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

洋金花果實采收于黑龍江中醫藥大學藥用植物園，經黑龍江中醫藥大學藥學院藥用植物教研室樊銳鋒鑒定為茄科曼陀羅屬植物白曼陀羅(DaturametelL.)的果實。原植物標本(20140905)保存于黑龍江中醫藥大學中藥化學教研室。

2 提取與分離

干燥的洋金花果皮(35 kg)，用70%乙醇提取3次，每次3 h，減壓回收溶劑，得提取物5.6 kg。提取物加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取。乙酸乙酯部分(110 g)經正相硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇系統(300:1-0:1)梯度洗脫，得到A～H 8個部分。E通過硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇系統，60:1-0:1)，得到10個流分。流分5直接析出白色沉淀即得化合物4(37 mg)。流分2、3、4、7經HPLC分離即得化合物1(28 mg)、2(14 mg)、3(13 mg)、5(17 mg)、6(10 mg)、7(13 mg)、8(12 mg)和9(12 mg)。C通過硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇系統，30:1-0:1)，得6個流分。流分3經HPLC分離即得化合物10(22 mg)。

3 結構鑒定

3.1 化合物1

無色針狀結晶(甲醇)。ESI-MS m/z：311.131 7 [M+H]+，分子式為C18H18N2O3。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：3.94(1H, t, J=5.4 Hz, H-2)，3.91(1H, t, J=5.4 Hz, H-12)，2.18(2H, m, H-3)，2.57(2 H, m, H-13)，6.83(2H, d, J=8.4 Hz, H-15, 19)，6.67(2H, d, J=8.4 Hz, H-16, 18)，7.03(2H, d, J=7.0 Hz, H-5, 9)，7.24(2H, m, H-6, 7, 8)。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：55.4(C-2)，38.5(C-3, 13)，136.6(C-4)，129.7(C-5, 9)，128.2(C-6, 8)，126.4(C-7)，166.2(C-10)，55.7(C-12)，126.4(C-14)，130.8(C-15, 19)，115.0(C-16, 18)，156.1(C-17)，166.1(C-20)。以上數據與文獻報道[7]數據對比，鑒定化合物1為cyclo(PheTyr)。

3.2 化合物2

無定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：257.084 8 [M+H]+，分子式為C14H12N2O3。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：8.15(1H, d, J=5.2 Hz, H-3)，7.75(1H, d, J=5.2 Hz, H-4)，7.94(1H, d, J=8.5 Hz, H-5)，6.69(1H, dd, J=8.5 Hz, J=2.1 Hz, H-6)，6.89(1H, d, J=1.9 Hz, H-8)，2.83(1H, t, J=7.3 Hz, H-1′)，3.26(1H, t, J=7.3 Hz, H-2′)，11.3(1H, br.s, NH)。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：142.8(C-1)，137.3(C-3)，111.8(C-4)，122.5(C-5)，109.7(C-6)，158.2(C-7)，96.6(C-8)，142.3(C-9)，113.8(C-10)，127.7(C-11)，133.9(C-12)，31.4(C-1′)，27.8(C-2′)，174.1(C-3′)。以上數據與文獻報道[8]數據對比，鑒定化合物2為9-hydroxycanthin-6-one。

3.3 化合物3

白色粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：160.028 0 [M+H]+，分子式為C4H5N3O4。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：10.5 (1H, s, 7-COOH)，5.2(1H, dd, J=1.2 Hz, J=8.2 Hz, H-4)，5.8(1H, s, 3-NH)，6.9(1H, d, J=8.2 Hz, 6-NH)，8.0(1H, s, 1-NH)。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：173.5(C-7)，157.4(C-5)，156.7(C-2)，62.4(C-4)。以上數據與文獻報道[9]數據對比，鑒定化合物3為(2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid。

3.4 化合物4

無色結晶(甲醇)。ESI-MS m/z：325.329 1 [M+H]+，分子式為C15H20N2O6。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：11.86(1H, s, 4-NH)，6.92(1H, s, H-5)，7.33(1H, s, H-8)，2.19(3H, s, H-11)，2.22(3H, s, H-12)，4.52(1H, d, J=3.8 Hz, H-1′a)，3.99(1H, d, J=2.1 Hz, H-1′b)，4.05(1H, m, H-2′,)，3.58(1H, m, H-3′)，3.61(1H, m, H-4′)，3.44(1H, m, H-5′a)，3.58(1H, m, H-5′b)；13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：155.7(C-2)，153.8(C-3)，116.0(C-5)，131.2(C-6)，130.9(C-7)，116.5(C-8)，124.9(C-9)，123.3(C-10)，19.3(C-11)，18.7(C-12)，44.5(C-1′)，68.1(C-2′)，73.6(C-3′)，72.7(C-4′)，63.4(C-5′)。以上數據與文獻報道[10]數據對比，鑒定化合物4為1-ribityl-2,3-diketo-1,2,3,4-tetrahydro-6,7- dimethyl-quinoxalin。

3.5 化合物5

棕色膏狀物(甲醇)。ESI-MS m/z：625.247 2 [M+H]+，分子式為C36H36N2O8。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：169.4(C-10″)，165.2(C-10′)，155.6(C-4′)，155.6(C-4″)，148.7(C-4)，147.6(C-3?)，146.8(C-4?)，144.0(C-3)，138.7(C-7)，130.5(C-1?)，129.5(C-2′, 6′)，129.4(C-2″, 6″)，129.2(C-1′, 1″)，128.5(C-1)，128.5(C-5)，119.6(C-8)，118.8(C-6?)，115.9(C-6)，115.4(C-5?)，115.1(C-3′, 5′)，115.1(C-3″, 5″)，111.7(C-2)，110.3(C-2?)，87.6(C-7?)，55.8(C-8?)，55.7(3-OCH3)，55.6(3?-OCH3)，40.8(C-8′)，40.7(C-8″)，34.3(C-7′)，34.1(C-7″)。以上數據與文獻報道[11]數據對比，鑒定化合物5為grossamide。

3.6 化合物6

白色無定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：625.247 2 [M+H]+，分子式為C36H36N2O8。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：125.5(C-1)，112.5(C-2)，148.9(C-3)，147.5(C-4)，115.2(C-5)，122.3(C-6)，126.3(C-7)，141.6(C-8)，168.8(C-9)，56.1(3-OCH3)，130.8(C-1′)，130.7(C-2′)，116.3(C-3′)，157.0(C-4′)，116.3(C-5′)，130.7(C-6′)，35.6(C-7′)，42.2(C-8′)，131.9(C-1″)，113.8(C-2″)，150.5(C-3″)，149.5(C-4″)，116.3(C-5″)，125.3(C-6″)，141.1(C-7″)，121.0(C-8″)，165.5(C-9″)，56.5(3?-OCH3)，131.3(C-1?)，130.7(C-2?)，116.3(C-3?)，156.9(C-4?)，116.3(C-5?)，130.7(C-6?)，35.8(C-7?)，42.6(C-8?)。以上數據與文獻報道[12]數據對比，鑒定化合物6為cannabisin F。

3.7 化合物7

無定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：290.167 8 [M+H]+，分子式為C17H23NO3。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：59.9(C-1)，34.1(C-2)，65.6(C-3)，34.2(C-4)，60.0(C-5)，23.9(C-6)，24.2(C-7)，38.3(C-8)，171.2(C-9)，54.3(C-10)，63(C-11)，136.2(C-12)，128.6(C-13)，128(C-14)，127.3(C-15)，128(C-16)，128.6(C-17)。以上數據與文獻報道[13]數據對比，鑒定化合物7為hyoscyamine。

3.8 化合物8

無定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：284.120 8 [M+H]+，分子式為C17H17NO3。13C-NMR(100 MHz, CD3OD)δ：127.7(C-1)，130.6(C-2)，116.3(C-3)，160.5(C-4)，116.3(C-5)，130.6(C-6)，141.8(C-7)，118.4(C-8)，169.3(C-9)，131.3(C-1′)，130.7(C-2′)，116.7(C-3′)，157.0(C-4′)，116.7(C-5′)，130.7(C-6′)，35.8(C-7′)，42.6(C-8′)。以上數據與文獻報道[14]數據對比，鑒定化合物8為Trans-N-p-coumaroyltyramine。

3.9 化合物9

白色晶體(甲醇)。 ESI-MS m/z：330.126 3[M+H]+，分子式為C18H19NO5。13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ：128.3(C-1)，111.6(C-2)，149.9(C-3)，149.3(C-4)，116.5(C-5)，123.4(C-6)，142.4(C-7)，118.7(C-8)，169.6(C-9)，134.7(C-1′)，128.5(C-2′)，116.2(C-3′)，158.1(C-4′)，116.2(C-5′)，128.5(C-6′)，73.5(C-7′)，56.4(3-OCH3)，48.3(C-8′)。以上數據與文獻報道[15]數據對比，鑒定化合物9為N-trans-feruloyloctopamine。

3.10 化合物10

不定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：330.126 3 [M+H]+，分子式為C18H19NO5。13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ：128.3(C-1)，111.6(C-2)，149.9(C-3)，149.3(C-4)，116.1(C-5)，123.3(C-6)，142.2(C-7)，118.7(C-8)，169.5(C-9)，134.7(C-1′)，128.4(C-2′)，116.5(C-3′)，158.1(C-4′)，116.5(C-5′)，128.4(C-6′)，73.4(C-7′)，48.3(C-8′)，56.4(3-OCH3)。將數據與文獻報道[16]數據對比，鑒定化合物10為(2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide。

4 抗腫瘤細胞活性測試

參照文獻方法[17]檢測化合物1～10在5、10、20、40和80 μg/mL濃度下對腫瘤細胞株肝癌HepG-2、肺癌A549及胃癌SGC-7901的抑制活性。紫杉醇作為陽性對照。結果見表1。

表1 化合物1～10的抗腫瘤活性

實驗結果表明，化合物1～10均表現出一定的抗腫瘤活性。其中，化合物1、2、5、6和8表現為較強的抗腫瘤活性。

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Alkaloids with Antitumor Activities from Pericarps ofDaturametelL.

YANG Bing-you,ZHOU Yong-qiang,LIU Yan,KUANG Hai-xue*

(Key Laboratory of Chinese Materia Medica of Ministry of Education, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Objective：To study the alkaloids from pericarps ofDaturametelL. and screen the antitumor activities of the isolated compounds. Methods：The separation and purification were taken by silica gel column chromatography, Sephadex-LH20 and semi-preparative HPLC, and the structural identification was based on physicochemical property,1H-NMR and13C-NMR as well as HR-MS data. The isolated compounds were evaluated according to antitumor activities of HepG-2, A549 and SGC-7901 by MTT method. Results：Ten alkaloids were obtained from the ethyl acetate of 70% ethanol extract of pericarps of D. metel L. and the structures were identified as cyclo(PheTyr)(1), 9-hydroxycanthin-6-one(2), (2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid(3), 1-ribityl-2,3-diketo-1,2,3,4-tetrahydro-6,7-dimethyl-quinoxaline(4), grossamide(5), cannabisin F(6), hyoscyamine(7), Trans-N-p-coumaroyl tyramine(8), N-trans-feruloyloctopamine(9) and (2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide(10), respectively. All isolated possessed the potential anti-tumor activity in vitro. Conclusion：Compounds 1-4 are isolated from the plants of Solanaceae for the first time, and compounds 1, 2, 5, 6 and 8 exhibit a strongly antitumor activity.

Solanaceae; Pericarps; Alkaloids;DaturametelL.; Antitumor activity

黑龍江省高校長江學者后備支持計劃(No.2013CJHB006)；黑龍江中醫藥大學研究生創新項目(No.yjscx2016010)

楊炳友(1970-)，男，教授，博士研究生導師，主要研究方向：中藥及復方藥效物質基礎研究。

匡海學*(1955-)，男，教授，博士研究生導師，主要研究方向：中藥及復方藥效物質基礎研究。

2017-01-21

R28

A

1002-2406(2017)03-0005-04

修回日期：2017-02-07