蘇木乙酸乙酯提取物對動脈粥樣硬化模型大鼠血脂及MMP-9的影響

楊建飛，魏來，張婧懿*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

蘇木乙酸乙酯提取物對動脈粥樣硬化模型大鼠血脂及MMP-9的影響

楊建飛1，魏來2，張婧懿1*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：應用蘇木乙酸乙酯提取物對動脈粥樣硬化(AS)大鼠模型進行干預，測定大鼠血脂及血清基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的水平，進而為蘇木乙酸乙酯提取物抗AS化作用提供客觀依據。方法:采用腹腔注射維生素D3建立AS模型。將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、蘇木低、中、高劑量組、辛伐他汀組，蘇木低、中、高劑量組分別給予蘇木乙酸乙酯提取物溶液10 ml/(kg·d)灌胃，分別相當于生藥量1.15 g/(kg·d)、2.30 g/(kg·d)、3.45 g/(kg·d)；辛伐他汀組灌服辛伐他汀溶液4.20 g/(kg·d)，空白組與模型組灌服等體積的羧甲基纖維素鈉溶液。4周后取各組大鼠胸主動脈及腹主動脈采血，取得血清，測定血脂水平，應用ELISA法檢測各組大鼠血清MMP-9的水平。結果：與空白組相比，模型組的TG、LDL-C、MMP-9水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與辛伐他汀組相比，蘇木高、中、低劑量組TG、LDL-C、MMP-9表達水平無明顯差異(P>0.05)；與模型組相比，蘇木高、中、低劑量組和辛伐他汀組的TG、LDL-C、MMP-9水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論：蘇木乙酸乙酯提取物能夠降低AS模型大鼠血脂及MMP-9的表達水平，其作用與辛伐他汀相當。

動脈粥樣硬化；甘油三酯；低密度脂蛋白膽固醇；蘇木；基質金屬蛋白酶-9

隨著人們生活水平的不斷改善，心腦血管疾病的患病率在逐年增長，并且嚴重威脅人類健康以及生活質量，而其真正的幕后推手正是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。其致病原因尚未完全明確，但是細胞外基質的降解、脂質浸潤、血流動力學的改變等多種原因在其形成和發展過程中起到了重要的作用。已有研究表明，炎癥反應貫穿AS始終，且發揮著不可替代的重要作用，其中基質金屬蛋白酶組(Matrix Metalloproteinases，MMPs)在降解和重構細胞外基質過程中起決定性作用，導致斑塊穩定性遭到破壞，因而加速了AS進程，而在MMPs中占重要地位的MMP-9應得到足夠的重視，其參與了細胞外基質降解以及重構的全過程，在AS的斑塊形成、血管重構、斑塊穩定性失衡、斑塊破裂過程中其表達過度和活性增強，是心血管事件中較為重要的的預測因子之一[1-2]。目前經研究證實部分活血化瘀類中藥單體及復方能在不同程度上降低AS動物模型的血脂水平，對內皮細胞結構和功能具有保護作用。而中藥蘇木作為活血化瘀藥應用于臨床已有數千年的歷史，近年來更發現其還具有免疫抑制、抗腫瘤、抗炎及抗氧化等藥理作用[3-8]。因此我們再此基礎上提出假說，蘇木乙酸乙酯提取物作為蘇木的有效部位，可通過調節血脂，調整內皮功能，發揮其抗炎免疫作用從而抑制動脈粥樣硬化的進展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級近交系SD大鼠55只，成年雄性，體質量200～250 g，選取通風、溫度、濕度都比較適宜的動物室內飼養。實驗動物購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2015-0001。

1.2 蘇木乙酸乙酯提取物的制備

蘇木，產地云南，購自黑龍江省藥材公司，經生藥鑒定制成蘇木粗粉(40目)。用乙醇浸泡，加熱，回流，過濾，將合并后的濾液水浴蒸干，烘干制成乙醇提取干粉。使用雙蒸水混懸乙醇提取干粉，之后用乙酸乙酯萃取，回收溶劑得到乙酸乙酯提取物。

1.3 實驗藥物

辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司)；維生素D3(江蘇吳中醫藥集團有限公司)；烏拉坦(上海浩然生物技術有限責任公司)；福爾馬林(江蘇凱茂石化科技有限公司)；羧甲基纖維素鈉(河北石家莊森隆化工有限公司)；ELISA試劑盒(上海康郎生物技術有限公司)。

辛伐他汀片溶于羧甲基纖維素鈉10 ml中，稀釋成濃度為0.42 mg/ml的懸濁液；蘇木乙酸乙酯提取物溶于羧甲基纖維素鈉10 ml中，配制成濃度為0.115 g/ml的蘇木乙酸乙酯提取物懸濁液，室溫留存備用。

1.4 AS模型的建立

大鼠腹腔內注射維生素D370萬IU/(kg·d)，連續3天。之后飼喂高脂飼料(配方為0.5%膽酸鈉、3%膽固醇、5%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、91.3%普通飼料)12周，造模大鼠分籠飼養，飲用潔凈水。

1.5 實驗分組及給藥

實驗大鼠適應性喂養1周之后隨機分為6組(空白組、模型組、蘇木乙酸乙酯低劑量組、蘇木乙酸乙酯中劑量組、蘇木乙酸乙酯高劑量組、辛伐他汀組)，每組8只。空白組給予普通飼料喂養(配方為麩皮24.5%、魚粉6%、豆餅12%、玉米24.5%、大麥21%、其他輔料12%)，其余組大鼠應用上述方法復制AS模型。蘇木乙酸乙酯低、中、高劑量組分別按1.15 g/(kg·d)、2.30 g/(kg·d)、3.45 g/(kg·d)給予蘇木乙酸乙酯提取物溶液灌胃;辛伐他汀組的劑量按體表面積等效劑量比換算，灌服4.2 mg/(kg·d)；空白組及模型組灌服等體積羧甲基纖維素鈉10 ml/(kg·d)。

1.6 標本取材

造模12周后處死3只大鼠，應用電子顯微鏡觀察腹主動脈血管壁是否有AS的血管內皮損傷形成。待給藥28天后，進行腹主動脈采血，離心，取血清，-20℃冰箱內冷藏，進行血脂檢測及ELISA法檢測；采集腹主動脈，縱行剪開，固定、包埋、切片，進行HE染色。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 病理形態學觀察

在電鏡下觀察，腹主動脈血管壁呈AS內皮損傷改變，提示造模成功。本次研究發現模型組、辛伐他汀組、蘇木組血管內皮發生病理性改變，經給予藥物干預后蘇木組及辛伐他汀組病理改變較模型組減輕，而辛伐他汀組與蘇木組病理改變程度相當。結果見圖1。

圖1 各組大鼠病理形態學結果(HE染色)

2.2 血脂檢測比較

結果顯示：高脂飼料飼養下的模型組血清中的TG、LDL-C水平升高，與正常飼料飼養下的空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)；蘇木低劑、中、高劑量組、辛伐他汀組血清中的TG、LDL-C水平降低，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。與辛伐他汀組比較，蘇木高、中、低劑量組血清TG、LDL-C的水平無差異(P>0.05)。見表1。

2.3 大鼠血清MMP-9含量測定

實驗結果表明，模型組、辛伐他汀組、蘇木低、中、高劑量組MMP-9水平升高，與空白組比較有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，蘇木低、中、高劑量組及辛伐他汀組血清MMP-9的水平降低，與空白組比較有顯著性差異(P<0.05)；與辛伐他汀組比較，蘇木低、中、高劑量組MMP-9水平無顯著性差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血脂檢測結果

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，▲P>0.05。

表2 各組大鼠血清MMP-9水平的變化

注:與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，▲P>0.05。

3 討論

據《中國心血管病報告2013》的報道顯示，目前全國心血管病的患者高達2.9億人，也就是說平均每5人中有1人患心血管病。而心血管疾病的始動環節即為動脈粥樣硬化，多數學者認為其與脂質代謝異常關系最為密切，是急性冠脈綜合征及腦卒中等心腦血管事件的主要病理基礎。尋找和探索有關AS的治療新策略對于降低心血管疾病的死亡率意義重大。血脂代謝異常是AS發生發展最重要且與之關系最緊密的因素之一，經生化學證實其沉積于動脈內膜的脂質成分以游離膽固醇和膽固醇酯為主，其中LDL被確定為AS的獨立危險因素之一。有研究表明[9-11]，許多具有活血祛瘀活性的中藥均可對血脂代謝產生影響，通過改善血脂代謝，降低TG、LDL-C水平產生抗AS的作用。關于AS形成的明確病因尚未確定，除脂質浸潤學說外，血流動力學說、炎癥反應學說、內皮損傷反應學說等多種學說存在已久，炎癥反應學說目前被人們普遍關注，認為AS的進程就是炎癥反應的過程[12]。炎癥反應在AS形成、發展及演變過程中起重要作用，血清MMP-9是反映機體炎癥反應比較敏感的指標，細胞外基質是血管壁的重要組成部分，其降解和重塑過程參與了AS的形成與發展的全過程，而參與降解的炎癥因子主要是MMPs，臨床上細胞外基質的過度降解使AS斑塊易于破裂出血引起急性冠脈綜合征的發生等情況[13]。解冰川等[14]認為,導致心、腦血管疾病發生率增加的重要危險因素是AS斑塊形成及破裂出血，MMP-9始終存在并長期作用，MMP-9對細胞外基質的降解和重塑均有重要意義，在出血性腦卒中及缺血性腦卒中的生理、病理變化過程中均起著重要作用，對于前者來說MMP-9可使血腦屏障遭到破壞，使腦水腫加重從而加重腦損害。所以對AS的抗炎治療包括抑制MMP-9的活性，可能是防治心腦血管疾病的新的突破口。

實驗結果表明，給予高、中、低劑量蘇木乙酸乙酯提取物或辛伐他汀治療可不同程度降低AS模型大鼠血清MMP-9水平，同時能調節血脂。所以我們可以得出結論:蘇木乙酸乙酯提取物能夠降低動脈粥樣硬化模型大鼠TG、LDL-C及MMP-9的水平，可能是其抗動脈粥樣硬化作用的原因之一。

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國家科技重大專項課題(No.2009ZX09103425)；黑龍江省中醫藥科研項目(No.ZHY16-002)

楊建飛(1984-)，女，主治醫師，博士，黑龍江中醫藥大學中西醫結合流動站在站博士后，主要從事中醫內科心血管方向臨床、科研及教學工作。

張婧懿*(1984-)，女，工程師，碩士，主要從事中醫診療數字化、數據挖掘、統計等方面的研究工作。

2017-01-06

R285.5

A

1002-2406(2017)03-0014-03

修回日期：2017-01-30