電針對卵巢摘除大鼠E2水平及相關受體表達的影響

張博，葉陽，張雨薇，張淑香，黃樹明，孫忠人*

(1.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

針 灸 推 拿

電針對卵巢摘除大鼠E2水平及相關受體表達的影響

張博1，葉陽2，張雨薇2，張淑香1，黃樹明1，孫忠人2*

(1.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察電針對卵巢摘除大鼠E2水平及海馬ERα和TrkA表達的影響。方法：SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和電針組，除假手術組外，其余2組均進行卵巢切除術制備模型，15天后，電針組大鼠給予電針刺激，隔日1次，持續45天。觀察各組大鼠進行一般狀態，采用ELISA法檢測血清E2水平，并通過免疫組化法測定大鼠海馬CA1區ERα和TrkA含量。結果：與假手術組比較，模型組大鼠一般狀態較差，血清E2水平明顯降低，海馬CA1區ERα和TrkA表達明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，電針組大鼠一般狀態得到改善，血清E2水平升高(P<0.05)，海馬CA1區ERα和TrkA表達明顯升高(P<0.01,P<0.05)。結論：電針可提高卵巢摘除大鼠的E2水平，影響海馬CA1區ERα和TrkA表達，這可能是電針改善卵巢摘除大鼠記憶障礙的機制之一。

電針；卵巢摘除；雌二醇；雌激素受體α

絕經后女性認知功能下降的同時伴隨雌激素水平明顯降低[1]，激素替代療法可在絕經早期改善雌激素水平和認知功能[2]，但這一療法頗具爭議[3]。針刺可改善低雌激素水平動物模型的認知功能[4]，但相關機制有待明確。雌激素和腦內神經生長因子分別通過與雌激素受體α(estrogen receptor，ERα)和酪氨酸激酶受體A(tropomyosin receptor kinase A，TrkA)結合而實現神經元保護作用。本實驗對各組大鼠進行一般狀態的觀察，并采用酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定大鼠血清雌二醇(17β- estradiol，E2)水平，通過免疫組化法檢測大鼠海馬區ERα和TrkA表達情況，以期為后續的臨床研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組和模型制備

3月齡雌性SD大鼠，體質量190～220 g，36只。隨機分為3組，假手術組，模型組和電針組。給予各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 ml/100 g)，模型組和電針組大鼠進行雙側卵巢切除術，假手術組僅切開皮膚，術后予以青霉素8萬U肌注3天。

1.2 選穴、治療和取材

電針組大鼠卵巢切除15天后進行電針治療，根據《實驗針灸學》選取“百會”“腎俞”“后三里”穴[5]，在不麻醉狀態下，選用半寸針灸針針刺相應穴位。采用疏密波，頻率5 Hz，強度為4～5 mA，強度以引起大鼠后肢抖動為宜，在上午9～10點進行，每次30 min，隔日1次，兩側穴位交替進行電針刺激，百會穴每次均給予刺激，隔日1次，治療45天。治療結束后，將大鼠麻醉，眼底取血，分離血清，隨后進行灌流固定，取腦，浸于4%多聚甲醛中固定24 h后，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

1.3 試劑與儀器

ERα一抗(博奧森，bs-0725R)；TrkA一抗(博士德，BA0404)；SABC免疫組化試劑盒(博士德，SA1022)；Cloud- Clone ELISA試劑盒；MUTISKAN MK3型酶標儀(Thermo)；ECLIPSE 50i顯微鏡(Nikon)；KD-TS3D1型生物組織自動脫水機(浙江科迪)；TB-718型生物組織自動包埋機(湖北泰維)；R138型輪轉式切片機(湖北泰維)；TK-212型自動恒溫漂片儀(湖北泰維)；TK-213型自動恒溫烘片儀(湖北泰維)。

1.4 大鼠一般狀態的觀察

觀察卵巢摘除及電針治療后大鼠的毛色，活動情況及對外界刺激的反應等情況。

1.5 ELISA法檢測各組大鼠血清E2水平

分別設標準孔、待測樣品孔和空白孔。空白孔加蒸餾水或標準品稀釋液，其余相應各孔中加待測樣品或不同濃度標準品50 μl，隨后每孔立即加入檢測溶液A工作液50 μl，37℃溫育1 h。洗滌，各孔加檢測溶液B工作液100 μl，37℃溫育30 min。每孔加入底物溶液90 μl，37℃避光顯色20 min。每孔加入終止液50 μl，混勻后即刻用酶標儀在450 nm波長測量各孔OD值。

1.6 免疫組化檢測

將固定后的腦組織矢狀切開后，經組織自動脫水機按梯度脫水透明，石蠟包埋成蠟塊。以4 μm厚切片，每隔5張取1張，進行免疫組化實驗。

免疫組化SABC法：脫蠟、水化； 3% H2O2室溫封閉15 min，以滅活內源性酶；熱修復20 min； 5%BSA室溫封閉20 min，甩去多余液體，不洗。滴加適當稀釋的兔抗ERα抗原的抗體(1∶100)，37℃孵育90 min；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min；滴加試劑SABC，37℃孵育20 min；以上各步驟間，PBS洗3次，各5 min； DAB顯色10 min，反應充分即用PBS終止反應；脫水、透明、封片、鏡檢。陰性對照用PBS替代一抗孵育。

將各組切片進行鏡下拍攝(200×),將棕黃色顆粒作為陽性參考，應用Image Pro Plus 6.0測量累積光密度(IOD)和陽性細胞面積(Area),依據公式:平均光密度=IOD/Area，計算ERα及TrkA的平均光密度。

1.7 統計分析方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態

隨著卵巢摘除天數的增多，大鼠體毛疏松不光亮，對外界的刺激反應遲緩，倦縮少動抱團。電針治療后，大鼠體毛光澤柔順，反應較敏捷，活動頻繁。與模型組比較，電針組大鼠的一般狀態有良好的改善。

2.2 電針對卵巢摘除大鼠血清E2水平的影響

研究結果顯示，卵巢摘除60天后，與假手術組相比，模型組大鼠的血清E2水平明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，經45天電針治療的大鼠血清E2水平升高(P<0.05)，見表1，提示電針提高了卵巢摘除大鼠的血清E2水平。

表1 電針對卵巢摘除大鼠血清E2水平的影響

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 電針對卵巢摘除大鼠海馬CA1區ERα含量的影響

ERα的陽性表達主要位于細胞膜上，見圖1。研究顯示，與假手術組相比，模型組海馬CA1區ERα表達明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，電針組海馬CA1區ERα表達明顯增多(P<0.01)，見表2。結果提示卵巢摘除減少了ERα表達，而電針治療可逆轉由卵巢摘除引起的ERα表達減少。

表2 電針對卵巢摘除大鼠海馬CA1區ERα含量的影響

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

2.4 電針對卵巢摘除大鼠海馬CA1區TrkA含量的影響

TrkA的陽性表達位于細胞膜及細胞漿，見圖2。實驗結果顯示，與假手術組相比，卵巢摘除大鼠海馬內TrkA含量明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，電針組大鼠海馬內TrkA含量增加(P<0.05)，見表3。結果提示卵巢摘除減少了大鼠海馬區TrkA表達，而電針治療可逆轉由卵巢摘除引發的TrkA表達減少。

圖1 各組大鼠海馬CA1區ERα表達 注：箭頭所示為ERα陽性表達。

圖2 各組大鼠海馬CA1區TrkA表達 注：箭頭所示為TrkA陽性表達。

組別n平均光密度假手術組80.07±0.01模型組80.05±0.01**電針組80.06±0.01#

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

本實驗所選用的卵巢切除術復制了女性絕經期的低雌激素水平，中醫學認為年老者多腎虛，因此本實驗以補腎為原則選取針刺穴位，分別為腎俞、后三里和百會穴。腎為先天之本，先天之精所藏之處，針刺腎俞可起到補益腎氣的作用。脾胃為后天之本，氣血生化之源，充盛人體先天之精，針刺后三里可健脾胃、 益氣血。百會乃諸陽之會，位于督脈上，針刺此穴可起到調理陰陽的作用。此三穴共同針刺，可起補腎益精、調理一身陰陽之效，這與西醫的提高性激素水平相近。本實驗結果證實，電針治療提高了卵巢摘除大鼠血清E2水平，并實現了大鼠毛色，反應速度及活動頻率等一般狀態的改善。有報道指出，針刺可增加模型動物雌激素水平[6],這與本實驗結果相一致。

雌激素具有調節腦內神經遞質，減輕神經毒性物質的損害及通過促進突觸生長等實現神經元保護作用[3]，在中樞神經系統的作用機制大致分為基因途徑和非基因途徑[7]。基因途徑即雌激素與位于細胞質和細胞核上的雌激素受體ERα和雌激素受體β(Estrogen receptor，ERβ)結合形成二聚體進入細胞核，與位于靶基因啟動區的雌激素反應因子結合或與其他轉錄因子和相應的反應因子相結合從而調控基因表達，此途徑的信號轉導起效迅速。神經生長因子與其受體TrkA結合后，才能起到增強神經元存活、分化及突觸可塑性的作用。本實驗結果顯示，卵巢摘除降低了大鼠海馬CA1區ERα和TrkA的表達，而電針百會、腎俞、后三里穴可逆轉二者表達減少，這可能與課題組前期研究發現的電針改善大鼠學習記憶能力有關[8-9]。電針不僅增加了E2水平，而且增加了相關受體的敏感性，進而實現了大鼠一般狀態和記憶功能的改善。研究證實，針刺腎俞，后三里可改善去勢大鼠的學習記憶能力[10]，針刺百會穴可增強正常大鼠的記憶能力[11]。這與本課題組前期實驗結果相一致。

然而，雌激素與ER復合物進入細胞核后，通過一系列反應才能實現生物學效應，如與雌激素受體反應原件(estrogen response elements，ERE)和CREB反應原件(CREB response elements，CRE)結合才能激活下游信號[12]，而以補腎為治療原則的針刺療法是否能激活這些因子的表達，還有待進一步實驗的深入研究。

[1] 王艷,任慕蘭.絕經后女性認知功能減退者血清性激素與腦源性神經營養因子的變化[J].生殖醫學雜志,2010,19(5):434-436.

[2] 秦家云,彭丹紅,王艷,等.激素補充治療對絕經早期婦女血清生殖激素水平與認知功能的影響[J].現代預防醫學,2012,39(18):4675-4677.

[3] 胡霽玲,宋陽,周堅紅,等.雌激素與女性認知功能關系的研究進展[J].生殖與避孕,2016,36(6):511-515.

[4] 唐曦,唐成林,謝洪武,等.電針改善低雌激素性認知功能障礙大鼠的學習記憶[J].生理學報,2013,65(1): 26-32.

[5] 李忠仁.實驗針灸學[M].2版.北京:中國中醫藥出版社,2007: 255-257.

[6] 張英,郭璠,王小云.電針對圍絕經期模型大鼠E2及胰島素樣生長因子的影響[J].中醫學報,2011,26(158): 816-817.

[7] Mahmoud R,Wainwright SR,Galea LA.Sex hormones and adult hippocampal neurogenesis:Regulation, implications,and potential mechanisms[J].Front Neuroendocrinol,2016,41: 129-152.

[8] 郝迪，劉宏，黃樹明.左歸丸對卵巢切除MCAO模型大鼠學習記憶功能的影響[J].中醫藥學報，2014,42(1)：122-124.

[9] 張玉昆，牛雯穎，姜廣坤，等.淫羊藿對雌性大鼠雙側卵巢摘除模型的影響[J].中醫藥學報，2016,44(3)：24-26.

[10] 唐曦,唐成林,謝洪武.切除卵巢對大鼠行為學和海馬神經元型一氧化氮合酶的影響及電針的干預作用[J].生物醫學工程學雜志,2013,30(4): 833-837.

[11] 景玉宏,王子仁.電針“百會”穴對大鼠記憶保持能力的影響及海馬區fos蛋白的表達[J].針刺研究,2004, 29(2): 107-110.

[12] Pike CJ, Carroll JC, Rosario ER, et al. Protective actions of sex steroid hormones in Alzheimer’s disease[J]. Front Neuroendocrinol,2009,30(2):239-258.

Effect of Electroacupuncture on E2Concentration and Expression of Related Receptors in Ovariectomized Rats

ZHANG Bo1, YE Yang2, ZHANG Yu-wei2, ZHANG Shu-xiang1, HUANG Shu-ming1, SUN Zhong-ren2*

(1.Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Objective: To observe the effect of electroacupuncture on E2concentration and expression of ERα and TrkA in ovariectomized rats. Methods: SD rats were randomly divided into three groups, Sham group, Model group and Electroacupuncture (EA) group.Rats in Model group and EA group were ovariectomized except those in Sham group. 15 days after operation,rats in EA group were treated by electroacupuncture, once every other day for 45 days. The general status of rats was observed,and the concentration of serum E2was measured by ELISA and expression of ERα and TrkA in hippocampal CA1 area was determined by immunohistochemical staining. Results: The general status of rats in Model group was worse than that in Sham group. Compared with Sham group, the Model group showed a declined concentration of serum E2and a decreased level of ERα and TrkA. However, the general status of rats was improved in EA group. Compared with Model group, EA group showed an increased concentration of serum E2and an increased expression of ERα and TrkA. Conclusion: Electroacupuncture can increase the concentration of serum E2and the expression of ERα and TrkA, and this may be one of the mechanisms for electroacupuncture to improve the memory dysfunction induced by ovariectomy in rats.

Electroacupuncture;Ovariectomy;Estradiol;Estrogen receptor α

國家自然科學基金青年科學基金項目(No.81603321)；黑龍江省博士后資助項目(No.LBH-Z13200)；黑龍江省自然科學基金項目(No.H2016072)；黑龍江中醫藥大學科研基金項目(No.2015bs04)

張博(1984-)，女，中醫學博士后，助理研究員，主要研究方向：中醫藥防治老年性癡呆。

孫忠人*(1960-)，男，教授，博士研究生導師，主要研究方向：針刺防治腦與脊髓神經疾病。

2016-12-10

R246

A

1002-2406(2017)03-0074-04

修回日期：2016-12-27