冷沉淀凝血因子制備技術(shù)的應(yīng)用研究

畢承恩，楊 婷，馬佩琴，羅曉梅，歐陽克梅，程 勤，郭 瓊

（昭通市中心血站，云南 昭通 657000）

冷沉淀凝血因子制備技術(shù)的應(yīng)用研究

畢承恩，楊 婷，馬佩琴，羅曉梅，歐陽克梅，程 勤，郭 瓊

（昭通市中心血站，云南 昭通 657000）

目的通過研究冷沉淀凝血因子的制備技術(shù)和推廣應(yīng)用，開發(fā)新的血液品種，提高輸血療效和水平。方法采集全血迅速制備成新鮮冰凍血漿后速凍，-18℃以下冰箱保存，通過融化、離心、分離、速凍等工序制備出冷沉淀凝血因子，并對其進行抽樣檢測。結(jié)果通過檢測188袋成品冷沉淀凝血因子，0.75 U冷沉淀凝血因子FⅧ含量（131.27±32.32）IU/袋、Fg含量（132.43±23.48）mg/袋，1 U冷沉淀凝血因子FⅧ（146.13±32.67）IU/袋、Fg含量（161.93±14.08）mg/袋，符合國家《全血及成分血質(zhì)量要求》標準。結(jié)論制備的冷沉淀凝血因子質(zhì)量合格，臨床療效顯著，保障了凝血因子Ⅷ、凝血因子ⅩⅢ、纖維蛋白原、血管性血友病因子缺乏患者治療的需要，特別是在ICU、創(chuàng)傷性大出血、產(chǎn)科DIC時搶救了大量的患者，產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益和社會價值，值得推廣應(yīng)用。

冷沉淀凝血因子；應(yīng)用；制備技術(shù)；研究

冷沉淀凝血因子是將保存期內(nèi)的新鮮冰凍血漿在1～6℃的溫度下，將大部份血漿分離，不溶解的部分物質(zhì)使其在1h內(nèi)速凍呈固態(tài)成分血的過程[1]。其中含豐富的凝血因子Ⅷ（FⅧ）、、凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）血管性血友病因子（von Willebrand因子，VwF）、纖維蛋白原（Fg）以及纖維結(jié)合蛋白（Fn）等成分[2]，廣泛應(yīng)用于血液性疾病的手術(shù)及創(chuàng)傷引起的凝血性功能障礙性疾病[3-7]。我站于2012年開展此制備技術(shù)，并大量應(yīng)用于臨床，效果顯著，值得推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

MBF-21多美達速凍機、海爾-80℃低溫冰箱、BLT-1.35B低溫工作臺、KJX-Ⅲ低溫水浴冰凍血漿解凍箱、SIGMA 8K大容量低溫離心機、CR7大容量低溫離心機、CA-50凝血酶儀、INKUBATOR1000恒溫震蕩孵育箱、T5000型電子天平、CZK-IC微電腦采液控制器、天津天商冰源冷庫。

1.2 試劑

凝血Ⅷ因子試劑、FB試劑、APTT試劑、因子Ⅷ缺乏血漿均由德國Dade Behring Marburg公司提供，質(zhì)控血清由衛(wèi)生部臨檢中心提供，均在有效期內(nèi)使用。

1.3 血袋

山東威高集團醫(yī)用高分子制品有限公司四聯(lián)血袋

1.4 制備

采集全血后，6 h內(nèi)離心分離出血漿置MBF-21多美達速凍機中30 min內(nèi)將血漿中心溫度降至-30℃以下，-18℃以下冰箱保存至少7天備用。制備可以把冰凍的血漿放入4℃的水浴中融化，融化過程中輕微搖動血漿，當(dāng)血漿基本融化時，取出冰凍血漿，于大容量低溫離心機在（4±2）℃以2547 g的離心力離心10 min，將大部分上層血漿移至空袋，制成冰凍血漿，留下的不溶解的白色膠狀物即為冷沉淀凝血因子，與20～30 mL血漿混合制成冷沉淀凝血因子[8]，迅速置MBF-21多美達速凍機中速凍（1 h內(nèi)），-18℃以下冷凍保存。當(dāng)使用的時候，將冷沉淀放入37℃的水浴中進行融化后盡快輸注。

1.5 檢測標本

臨床推廣前，通過檢測20袋成品冷沉淀凝血因子，質(zhì)量合格后常規(guī)開展工作，每月隨機抽檢4袋成品冷沉淀凝血因子作為檢測標本。

1.6 FⅧ和Fg檢測方法

每月抽樣標本在CA-50凝血酶儀上分別進行檢測，測定出FⅧ和Fg的值后，再根據(jù)容量、稀釋倍數(shù)計算出FⅧ和Fg含量。

1.7 質(zhì)量標準

《全血及成分血質(zhì)量要求》GB18469-2012中，來源于300 mL的全血（0.75U）： FⅧ含量≥60 IU/袋，F(xiàn)g含量≥113 mg/袋；來源于400 mL的全血（1U）： FⅧ含量≥80 IU/袋，F(xiàn)g含量≥150 mg/袋。

2 結(jié) 果

2012～2015年我站共制備冷沉淀凝血因子19926袋，17478.5 U，質(zhì)量抽檢188袋。檢測結(jié)果見表1。

表1 2012年-2015年冷沉淀凝血因子抽檢檢測結(jié)果（s）

表1 2012年-2015年冷沉淀凝血因子抽檢檢測結(jié)果（s）

0.75 U 123 39.51±6.54 131.27±32.32 132.43±23.48 1 U 65 38.42±7.14 146.13±32.67 161.93±14.08

2012～2015年向我市臨床用血機構(gòu)推廣冷沉淀凝血因子19100袋，共計16693.75 U，其中昭通市第一人民醫(yī)院使用10833.75 U，占總使用量的64.89%，主要用于ICU、創(chuàng)傷性大出血、產(chǎn)科大出血、上消化道大出血、心胸顱腦大手術(shù)和凝血因子Ⅷ、凝血因子ⅩⅢ、纖維蛋白原、血管性血友病因子缺乏的血液系統(tǒng)疾病，臨床應(yīng)用未發(fā)現(xiàn)輸血不良反應(yīng)，臨床使用效果顯著，其使用情況見表2、表3。

表2 2012～2015年主要使用冷沉淀凝血因子醫(yī)療機構(gòu)統(tǒng)計表

表3 2013～2015年市一院臨床科室使用冷沉淀凝血因子統(tǒng)計表

3 討 論

3.1 冷沉淀凝血因子制備的干擾因素和注意事項

由于Ⅷ因子屬不穩(wěn)定的凝血因子，容易失活，從血液采集到制備過程中采血、制備、速凍、保存的時間和溫度都會影響冷沉淀凝血因子活性，因此冷沉淀的制備應(yīng)注意以下幾點：

1）順利完成靜脈穿刺、采血過程快速且要準確無誤，并盡快讓血液及抗凝劑充分的混合作為保證冷沉淀中Ⅷ因子保持高度活性的必要條件[9]。300 mL全血采集時間＞10 min、 400 mL全血采集時間＞13 min不可用于制備原料新鮮冰凍血漿。

2）血液采集后立即放冰箱保存，用專用血液運輸箱運輸血液，制備時使用低溫工作臺，確保血液采集后保存、運輸和制備過程始終置2～8℃環(huán)境，避免凝血因子降解。

3）新鮮冰凍血漿要求在4～6 h內(nèi)制備完成，此時間越短則Ⅷ因子的回收率越高。選留做冷沉淀凝血因子的新鮮冰凍血漿應(yīng)澄清、無色澤異常、無乳糜和蛋白析出。

4）新鮮冰凍血漿要快速將中心溫度降至-30℃以下，-18℃以下冰箱保存至少7天備用。短時間內(nèi)速凍血漿并低溫儲存7天以上，有利于新鮮冰凍血漿中不穩(wěn)定凝血因子的穩(wěn)定和抱團，制備過程中解凍離心時的溫度最好控制在1～6℃。

5）不同的冰凍血漿融化方法可對Ⅷ因子的產(chǎn)量產(chǎn)生不同的影響。融化的方法一般分為兩種:速融及慢融。慢融多放在4℃冰箱過夜自然融化，不易控制；速融使用低溫水浴冰凍血漿解凍箱中1～6℃快速融解，容易控制時間，減少人為因素影響，制備出凝血因子質(zhì)量更好[10]。

6）制備時采用離心法比虹吸法效果好。

3.2 冷沉淀凝血因子的主要成分及作用機理

我站冷沉淀凝血因子是由300 mL與400 mL的全血分離出的新鮮冰凍血漿加工而成，將400 mL的全血分離血漿所制成的冷沉淀凝血因子為1個單位，其中冷沉淀凝血因子含F(xiàn)Ⅷ80～120 IU、VwF因子20%～30%、ⅩⅢ因子20%～30%、纖維蛋白原150～250 mg，纖維結(jié)合蛋白500 mg[11]。我站抽檢的冷沉淀凝血因子每單位含F(xiàn)Ⅷ 115～170 IU、纖維蛋白原150～180 mg。

沉淀凝血因子的作用機制如下。

1）凝血因子Ⅷ（FⅧ）。FⅧ又稱抗血友病球蛋白，是冷沉淀中最主要凝血因子，是以單鏈形式被合成，但在血漿中，它是以由兩條在不同位點被酶切的單鏈（一條重鏈和一條輕鏈）組成的異二聚體再和Von Willebrand 因子形成的復(fù)合物形式存在。其功能是作為因子Ⅸa的輔因子參與因子Ⅸa對因子X的激活[11]，促進凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，凝血酶可將因子Ⅻ激活為纖維蛋白穩(wěn)定因子（Ⅻa），而纖維蛋白多聚體進一步通過交聯(lián)而形成相對穩(wěn)固的血栓，從而達到止血的效果。

2）纖維蛋白原（Fg）。Fg又稱凝血因子I，是凝血過程中一連串具有蛋白水解活性的凝血因子相繼激活的最終底物。凝血的最后一步即凝血酶的形成，作用于纖維蛋白原使之轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。它還是血小板間的橋梁，與血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅱa結(jié)合而介導(dǎo)血小板發(fā)生聚集反應(yīng)，其含量增高可使血小板的聚集功能發(fā)生改變[12]。Fg可以多種不同的方式與生物組織進行結(jié)合，從而發(fā)揮其止血及填充的作用，可以有效改善微循環(huán)，進而達到防止出血的目的。

3）凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）。FⅩⅢ曾稱纖維蛋白穩(wěn)定因子，是由2個α亞單位和2個β亞單位組成的四聚體，活性中心位于α亞單位。它在凝血過程中的主要作用是催化相鄰的纖維蛋白單體通過在其γ鏈及α鏈上的賴氨酸和谷氨酸殘基之間形成ε（γ-氨酸）賴氨酰鍵而共價交聯(lián)，使改變可溶性纖維蛋白的性質(zhì)，促進穩(wěn)固纖維蛋白形成凝塊。

4）纖維接合蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）。又叫纖維連接/粘連蛋白，作為相對分子質(zhì)量較高的糖類蛋白質(zhì)，可以有效促進纖維蛋白交聯(lián)、上皮細胞移行、細胞粘著、修復(fù)及分化的功效，同時具備止血及封固的作用。同時作為一種“趨化因子”，它能與衰老細胞、組織碎片、纖維蛋白復(fù)合物、纖維蛋白和細菌等結(jié)合，并促進單核細胞、上皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和其他免疫細胞遷移到創(chuàng)傷處，促進吞噬、凈化傷口，具有抑菌、抗感染的作用[13]，并與成纖維細胞、纖維蛋白凝塊共同形成支架的作用，最終促進細胞的生成與合成，促進DNA的合成[14]，從而促進傷口的愈合和組織的修復(fù)。另外，作為粘附結(jié)構(gòu)蛋白Fn可充當(dāng)間質(zhì)，相互粘附，加固不同細胞之間發(fā)生結(jié)合，對腫瘤細胞的擴散起到阻礙作用。

5）血管性血友病因子（VwF）。VwF是一種血管蛋白，由血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞合成，由不同量的亞單位組成的多聚體，相對分子質(zhì)量從50萬到數(shù)百萬不等。VwF的功能是作為因子Ⅷ的載體而對因子Ⅷ起穩(wěn)定作用，可使血小板粘附至膠原上，從而參與血小板的粘附、聚集功能。

3.3 臨床應(yīng)用

3.3.1 在外科中應(yīng)用

各種原因大出血如車禍傷、肝膽外科等所引發(fā)的嚴重失血，失血量越多，凝血因子丟失的也就越多，故如何有效的減少出血量，是進行患者搶救的關(guān)鍵，通過輸入懸浮紅細胞及大量冷沉淀可以有效且迅速對凝血因子進行補充，按1～1.5單位/KG體重進行輸入，例如體重為60 kg的患者出血2000 mL可以總計輸入8個單位（一個治療量），如此同時配合血小板1～2個治療量可以提高療效。另外當(dāng)發(fā)生嚴重的創(chuàng)傷、手術(shù)性創(chuàng)傷及感染時，患者的血漿會因消耗大量的纖維結(jié)合蛋白而顯著降低纖維結(jié)合蛋白的水平，大大降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能，抑制機能消除異物的能力。冷沉淀含豐富的纖維結(jié)合蛋白與凝血因子，可以通過改善內(nèi)臟微血管的功能來防治內(nèi)臟的過量出血。早期及時輸注冷沉淀，可對嚴重創(chuàng)傷及手術(shù)創(chuàng)傷患者血漿中的纖維結(jié)合蛋白活性進行有效的提高，增強血漿中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)防御吞噬能力，有效防止傷口感染，提高被損傷的血管與創(chuàng)傷的組織自身的修復(fù)能力，使患者早日康復(fù)出院。

行肝臟手術(shù)的患者術(shù)后肝功能受到嚴重損傷，與此同時會出現(xiàn)多重的凝血功能異常。原因大致可分為凝血因子的消耗增多與其合成功能受阻；血液中纖維蛋白溶酶含量的增多促使纖溶亢進及血小板的生成功能減退。諸多的原因使創(chuàng)面的愈合發(fā)生困難，此時在手術(shù)中為患者輸入冷沉淀便可以效地改善機體的凝血機制，提高術(shù)后傷口組織的愈合及恢復(fù)，從而避免在術(shù)中發(fā)生大出血，在提高肝移植手術(shù)安全性及成功率方面作用毋庸置疑。

彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）是以血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活與血管內(nèi)纖維蛋白沉著作為主要的特征，且過程常繼發(fā)出現(xiàn)纖溶或者纖溶受抑的綜合癥，DIC并不是一種單獨發(fā)生的疾病，而是多種嚴重基礎(chǔ)疾病如感染、病理產(chǎn)科、惡性腫瘤、大型手術(shù)及創(chuàng)傷等所致的病理性發(fā)生過程，嚴重出血是臨床的主要表現(xiàn)，并且伴隨著各臟器的障礙，內(nèi)臟微循環(huán)的栓塞，微血管出現(xiàn)病理性溶血性貧血等各種臨床癥狀。通常見DIC的病理生理過程，分為高凝血期、消耗性低凝血期和繼發(fā)性纖維蛋白溶解亢進期。DIC低凝期為凝血因子被大量消耗的時期，F(xiàn)V、FⅧ 、纖維蛋白原和血小板的缺乏最嚴重，同時其他的凝血因子水平也會持續(xù)不同程度的下降，常常會有繼發(fā)的纖維蛋白溶解性發(fā)生，治療DIC首先是去除誘發(fā)因素，在此基礎(chǔ)上控制出血和血栓，因此及時對患者體內(nèi)凝血因子進行有效的補充是搶救患者脫離危險的關(guān)鍵，甚至可以決定患者搶救的成功與否，而冷沉淀含有大量的因子Ⅷ、VwF、ⅩⅢ和Fn，是補充凝血因子的最好制品，但應(yīng)在充分抗凝基礎(chǔ)上方可使用[15]。聯(lián)合使用冷沉淀8～10 U（1.5單位/10 Kg體重）和血小板1～2個治療量，效果更好。

惡性腫瘤的患者因機體長期在消耗狀態(tài)下，患者的造血功能極為低下，血漿的凝血因子合成的量比消耗的要少。而冷沉淀中含有豐富的FⅧ、Fg、VwF、FⅩⅢ以及纖維結(jié)合蛋白，這類因子可以有效提高患者體內(nèi)的凝血因子的含量，減少凝血酶原時間（PT）及活化部分凝血活酶時間（APTT），提高FIB，可以有效改善患者在手術(shù)中的止血現(xiàn)象。有報道描述冷沉淀可以通過對纖維蛋白膜的形成，對手術(shù)的創(chuàng)面產(chǎn)生機械性的牽拉性作用，對創(chuàng)口的收縮起到有效促使用藥，對促進腫瘤患者后期放療口腔潰瘍的創(chuàng)面的愈合發(fā)揮積極作用。

在接受心臟外科手術(shù)的患者手術(shù)中因發(fā)生體外循環(huán)、血液稀釋、血小板的破壞、機體體溫的變化以及凝血因子的消耗隨之出現(xiàn)凝血功能的障礙，常以出血與滲血為主要癥狀。對比除了對血液采取保護措施外，對患者進行及時有效的成分輸血可以顯著改善患者的凝血功能異常，大大降低術(shù)后大出血的發(fā)生率。冷沉淀中具有豐富的FⅧ、FIB及VwF，可縮短FX活化時間，增加血小板功能，提高凝血酶形成的效率。所有冷沉淀的輸注在復(fù)雜的心臟手術(shù)與高危主動脈修復(fù)手術(shù)中，可以有效起到提高凝血功能的恢復(fù)，減少術(shù)后出血，大大縮短創(chuàng)面愈合的時間。

在中重度燒傷患者中應(yīng)用 燒傷后由于病情發(fā)展迅速，患者會伴有彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），在患者實施搶救的同時，及時輸注適量的冷沉淀不僅可以有效阻止DIC的發(fā)展，而且可以有效促進凝血機制的恢復(fù)。當(dāng)患者在后期發(fā)生嚴重感染，消耗血漿中大量的Fn，機體吞噬細胞的防御功能會大大降低，異物的清除功能明顯下降，在輸注適量的冷沉淀后患者的血漿中Fn的水平會明顯提高，冷沉淀的輸注半小時后表現(xiàn)最為明顯，2 h后Fn的濃度會保持相對穩(wěn)定的高水平狀態(tài)。

3.3.2 在內(nèi)、兒科中的應(yīng)用

冷沉淀凝血因子在血液內(nèi)科主要用于兒童及成人輕型血友病甲、血管性血友病、先天性以及獲得性纖維蛋白原缺乏癥患者的治療。而且其可以做為血友病甲治療的主要手段。血管性血友病患者的血漿中除了缺乏FⅧ，而且VwF的量和（或）質(zhì)等方面均有異常的表現(xiàn)，臨床主要是以皮膚出血，鼻腔出血，若是婦女則會出現(xiàn)月經(jīng)過多，用一般的的止血方法效果并不是很好。在冷沉淀中含有相對較高濃度的VwF，因此輸注適量的冷沉淀會有止血的效果。先天性凝血因子障礙的患者，出現(xiàn)顯著纖維蛋白缺乏時，可以使用冷沉淀治療代替凍干的纖維蛋白原治療。先天性FⅩⅢ缺乏可用冷沉淀補充，提高FⅩⅢ水平。

對于甲型血友病患者，按每單位冷沉淀凝血因子含F(xiàn)Ⅷ 100 IU計算，輕度的出血患者及時施與10～15 IU／kg體重，中度的出血患者者可施與20～30 IU／kg，重度出血患者者可以增加到40～50 IU／kg的用藥量。對于循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)超負荷的患者可以改用Ⅷ因子濃縮劑進行治療。血管性血友病與甲型血友病相比患者的病情差異比較大，給患者的藥劑用量很難有標準的用量范圍，血管性血友病患者的治療過程用量可以為每1袋/5 kg體重，1次/d，持續(xù)3～4天，觀察患者者出現(xiàn)遲發(fā)性的出血時，可以增加到7～10天。特別注意的是血小板型的血管性血友病患者使用冷沉淀沒有任何效果，需要輸注血小板來進行治療。接受治療的患者所需冷沉淀的劑量，一般會取決于其本身血漿中的纖維蛋白原的水平，成人一般正常劑量為16袋/次，當(dāng)纖維蛋白原水平恢復(fù)到0.5～1.0 g／L停止輸注。患者由于Ⅷ因子的缺乏而發(fā)生出血時，可對患者增加用量到1袋/5kg體重，間隔2～3周一次便可以達止血的目的。

冷沉淀在消化內(nèi)科主要用于消化道出血、胃炎、十二指腸炎等的治療。當(dāng)有消化道大出血時，輸入冷沉淀，在其Ⅷ因子作用下，冷沉淀中的纖維結(jié)合蛋白的生物膠作用對黏膜病變有明顯修復(fù)、愈合作用。

3.4 冷淀沉的局部使用

在嚴重?zé)齻矫娴膽?yīng)用，冷沉淀中纖維結(jié)合蛋白具有很強的生物活性，F(xiàn)n是非特異性的調(diào)理素，可以通過誘導(dǎo)巨噬細胞、成纖維細胞的集聚，增強創(chuàng)面的愈合速度，局部外用冷沉淀，可顯著提高燒傷創(chuàng)面Fn的濃度，利于上皮擴展，加速創(chuàng)面的愈合速度，很快控制炎癥，減輕或不留瘢痕，恢復(fù)迅速等優(yōu)點。對外科創(chuàng)面，竇道、不易愈合的瘺口，如肛瘺也可局部應(yīng)用。直接涂于患處可使支氣管瘺閉合，增加食管吻合部的強度，顯著減少肺組織纖維縫合線間的空氣或液體滲漏。口服冷沉淀具有纖維結(jié)合蛋白原生物膠的作用，可以明顯修復(fù)胃與十二指腸粘膜的病變與傷口愈合[16]。粘附結(jié)構(gòu)蛋白在冷沉淀中充當(dāng)間質(zhì)，通過相互粘附來發(fā)揮上皮細胞的作用，可有效促進傷口創(chuàng)面愈合，其在眼科角膜潰瘍的治療中效果突出。

冷沉淀凝血因子的制備成功，為我市臨床用血提供了新的成分品種，保障了凝血因子Ⅷ、凝血因子ⅩⅢ、纖維蛋白原及血管性血友病因子缺乏患者治療的需要，特別是在ICU、創(chuàng)傷性大出血、產(chǎn)科DIC時治療時搶救了大量的患者，能廣泛用于各級醫(yī)療機構(gòu)和臨床科室，其作用性質(zhì)在不同的角度多種形式參與凝血，顯著增強機體創(chuàng)面的愈合，其臨床的療效顯著，值得在臨床推廣應(yīng)用。

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本文編輯：吳玲麗

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ISSN.2095-8242.2017.001.27.04