多發性骨髓瘤不同分期患者中IL—6/IL—27的表達及臨床意義

關建民++楊書環++劉翠紅++張清德++夏天

摘要：目的 研究探討IL-27在多發性骨髓瘤（MM）不同分期患者中的表達情況，探討其意義。方法 采用ELISA 檢測MM患者及正常對照組血漿中IL-6及IL-27水平。結果 MM D-S I期患者血漿IL-27水平為（51.82±6.01）pg/ml，IL-6水平為（40.02±1.14）pg/ml，II期患者血漿IL-27水平為（55.92±5.31）pg/ml，IL-6水平為（46.99±1.01）pg/ml，III期患者IL-27水平為（60.09±8.01）pg/ml，IL-6水平為（50.54±1.98）pg/ml，明顯高于正常對照組[IL-27（8.29±4.41）pg/ml，IL-6（2.08±0.18）pg/ml]（P<0.05），組間比較具有統計學意義。結論 多發性骨髓瘤患者隨著病情進展，IL-6/IL-27表達均增高，提示IL-6/IL-27可能與疾病進展有關，提示了不良預后。

關鍵詞：IL-27；多發性骨髓瘤；發病機制

Expression of IL-6/IL-27 in Patients with Multiple Myeloma and its Clinical Significance

GUAN Jian-min1，YANG Shu-huan2，LIU Cui-hong2，ZHANG Qing-de1，XIA Tian2

（1.Heze Medical College，Heze 274000，Shandong，China；

2.Department of Hematology，Heze Municipal Hospital，Heze 274000，Shandong，China）

Abstract：Objective To investigate the expression of IL-27 in patients with multiple myeloma（MM）in different stages，and to explore its significance. Methods The levels of IL-6 and IL-27 in plasma of MM patients and normal controls were detected by ELISA.Results The level of serum IL-27 in patients with MM D-S I for a period of（51.82±6.01）pg/ml，IL-6（level 40.02±1.14）pg/ml，the plasma IL-27 level in patients with stage II（55.92±5.31） pg/ml，IL-6 level（46.99±1.01）pg/ml，IL-27 levels in patients with stage III（60.09±8.01）pg/ml，IL-6 level（50.54±1.98）pg/ml，significantly higher than the normal control group[IL-27（8.29±4.41）pg/ml，IL-6（2.08±0.18）pg/ml]（P<0.05），comparison between groups was statistically significant.Conclusion The patients with multiple myeloma as the disease progresses，the expression of IL-6/IL-27 was increased，suggesting that IL-6/IL-27 may be associated with disease progression，suggesting a poor prognosis.

Key words：IL-27；Multiple myeloma；Pathogenesis

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細胞性腫瘤，以骨髓中漿細胞惡性克隆性增生并分泌單克隆免疫球蛋白（M 蛋白）造成骨質損害為主要特征。既往研究發現[1-2]，IL-6細胞因子家族對多發性骨髓瘤的發生、發展及預后均起到較為重要的作用。IL-27是近年發現的一種新的IL-6/IL-12細胞因子家族成員，其在多發性骨髓瘤發病機制中的作用亦逐漸受到重視[3]。目前關于IL-27在多發性骨髓瘤患者中表達情況說法不一，本研究旨在檢測不同分期狀態下多發性骨髓瘤患者體內IL-6/IL-27表達情況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 50例MM患者為2012年3月～2016年2月在菏澤市立醫院、菏澤醫學專科學校附屬醫院住院的患者，所有患者均符合國內MM診斷標準[4]。其中男36例，女14例，中位年齡62（40～79）歲。臨床分期：DS I期15例，II期20例，III期15例。標本采集時患者均不存在急、慢性感染性疾病及自身免疫性疾病等。

1.2方法 統一應用ELISA方法檢測MM患者外周血血漿中IL-6/IL-27水平。患者確診后于化療前清晨、空腹采集外周靜脈血2～3 ml，肝素抗凝，6 h內室溫下2000 rpm/min離心10 min，吸取血漿，分裝后儲存于-70 ℃冰箱備用。

1.3實驗原理 用純化的IL-6/IL-27抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被單抗的微孔中依次加入IL-6/IL-27，再與HRP標記的IL-6/IL-27抗原結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-6/IL-27呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中IL-6/IL-27濃度。具體流程如下：①加樣：分別設待測樣品孔、標準孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。②溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。③配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。④洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復2～3次，拍干。⑤加酶：每孔加入酶標試劑50 μl。⑥溫育：操作同②。⑦洗滌：操作同④。⑧顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。⑨終止：每孔加終止液50 μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。⑩測定：以450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15 min以內進行。健康對照組：方法同上，確定無合并急、慢性感染性疾病、自身免疫性疾病等。

1.4試劑 IL-6水平檢測采用北京百奧萊博科技有限公司生產的雙抗體方法試劑（Sheep interleukin 6，IL-6 ELISA KIT），規格96T/盒。IL-27水平檢測采用上海博研生物科技有限公司生產的試劑（human Interleukin 27，IL-27 Elisa KIT），規格，48T/盒 。

1.5統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計處理。數據用（x±s）表示，進行t檢驗分析。P<0.05認為有統計學意義。

2 結果

MM D-S I期患者血漿IL-27水平為（51.82±6.01）pg/ml，II期患者血漿IL-27水平為（55.92±5.31）pg/ml，III期患者IL-27水平為（60.09±8.01）pg/ml，組間比較具有統計學意義（P<0.05），明顯高于正常對照組[（8.29±4.41）pg/ml]（P<0.05）。我們以IL-6為陽性對照，D-S I期MM患者血漿IL-6水平為（40.02±1.14）pg/ml，II期MM患者血漿IL-6水平為（46.99±1.01）pg/ml，III期MM患者血漿IL-6水平為（50.54±1.98）pg/m，明顯高于較正常對照組[（2.08±0.18）pg/ml]（P<0.05），見表1。

3 討論

多發性骨髓瘤（MM）是一類惡性克隆性漿細胞疾病，在血液系統腫瘤性疾病里預后較差，應用化學治療的療效欠佳，近年來新型藥物的應用及自體干細胞移植等新方法使MM的疾病緩解率有所提高。細胞因子在腫瘤免疫中發揮重要作用，重組細胞因子已成為目前生物治療中一種重要的治療制劑，目前IL-2及IL-11等細胞因子已獲準用于疾病治療，一些細胞因子（如IL-12、IFN、TNF）應用于抗腫瘤治療已經取得一定的效果。IL-12可以誘導Th1細胞，CTL及NK細胞產生IFN-γ進而發揮強大抗腫瘤作用[5]，而嚴重的副作用限制了IL-12的臨床應用。在多發性骨髓瘤患者中，IL-6是骨髓瘤細胞生存生長的關鍵因子，在疾病進程中，骨髓瘤細胞以及骨髓基質細胞、破骨細胞、成骨細胞等可以同過自分泌以及旁分泌的形式分泌IL-6，從而促進細胞增殖并阻礙細胞凋亡。多發性骨髓瘤患者骨髓基質細胞還可以通過持續的IL-6的生成，以抵抗化療藥物誘導的骨髓瘤細胞凋亡作用。我們的研究可以看出，多發性骨髓瘤患者IL-6的水平中位值在不同分期患者有所不同，分別Ⅰ期約（40.02±1.14）pg/ml，Ⅱ期約（46.99±1.01）pg/ml，Ⅲ期約（50.54±1.98）pg/ml，均明顯高于正常對照組患者。本研究顯示，IL-6的水平與疾病分期相關，因此IL-6水平可作為評價患者預后的重要指標。體外研究證明[6]，多發性骨髓瘤患者的成骨細胞或破骨細胞，可促進IL-6的大量分泌，而IL-6可反饋性的促進骨髓瘤細胞增殖以及增強骨髓瘤細胞抗凋亡作用。我們期望進一步探討IL-6在多發性骨髓瘤中的分泌及作用機制的研究，從而為多發性骨髓瘤的臨床治療提供更多理論依據，同時多發性骨髓瘤患者血清IL-6檢測標本取材比較方便、價格便宜，作為多發性骨髓瘤患者的常規血清檢查，能幫助有效提示患者的病情及預后，為臨床治療提供更多的選擇。

IL-27作為一種新發現的IL-6/IL-12家族的細胞因子，是一種由p28和Ebi3組成異源二聚體的新型白介素，它能作用于活化的NK細胞和T細胞，并增強IL-12介導IFN-Y的產生，其抗腫瘤作用是目前所關注的焦點。與其他細胞因子一樣，IL-27也與腫瘤息息相關，尤其是人類急性髓系白血病，可直接抑制腫瘤細胞。IL-27抗腫瘤作用已經在多種動物實驗模型中得到證實，經過IL-27刺激的腫瘤細胞在實驗動物中形成的腫瘤，體積明顯縮小，并發現IL-27的抗腫瘤作用主要依賴于有特異性殺傷作用的CD8+T細胞（CTL）和體內其他細胞產生的IFN-γ[7-9]。糖蛋白130（glucoprotein130，gp130）是IL-6 和IL-27受體系統的共享信號轉導蛋白β 鏈，屬細胞因子受體超家族的成員，信號傳遞鏈gp130 激活是骨髓瘤細胞異常增殖的重要信號，主要通過gp130 而促進骨髓瘤細胞增殖[10-11]。MM作為一種漿細胞惡性腫瘤，IL-27在其發病機制中的作用備受關注[12]。有不同學者研究發現[13]，給小鼠采用兩種不同的方法注射兩種不同的MM細胞系，重組人IL-27可顯著的抑制腫瘤生長，原代MM細胞表面表達功能性的IL-27受體，IL-27通過抑制血管新生顯著抑制原代MM細胞和MM系生長，從骨髓瘤患者分選出來的破骨祖細胞亦顯著表達IL-27受體，在體外IL-27可直接抑制破骨細胞分化和溶骨活性[14]。目前尚無太多關于IL-27在不同分期MM患者體內表達分泌的報道，且說法不一，因此我們檢測了不同分期MM患者中IL-27的表達情況，結果顯示MM患者IL-27表達明顯高于正常對照組，且隨著疾病進展，IL-27表達增高，我們認為，IL-27在多發性骨髓瘤的發病中可能發揮著促進MM細胞增殖、血管新生和破骨細胞活性。IL-27與IL-6在不同時期的MM患者中同樣高表達，共享同一受體亞單位gp130，發揮著相同的作用，我們期望進一步探討IL-27在MM中的分泌及作用機制的研究，從而為為MM的臨床治療提供有關IL-27的更多理論依據，也為MM的臨床治療提供更多的選擇。

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編輯/成森