膠質細胞源性神經營養因子修飾的骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷的效果

吳 朗, 黃 成, 馮新民, 畢松超, 陳 濤, 王 鵬, 楊建東

(揚州大學臨床醫學院, 江蘇 揚州, 225000)

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膠質細胞源性神經營養因子修飾的骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷的效果

吳 朗, 黃 成, 馮新民, 畢松超, 陳 濤, 王 鵬, 楊建東

(揚州大學臨床醫學院, 江蘇 揚州, 225000)

目的 觀察膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)修飾的骨髓間充質干細胞( BMSCs)分化為神經元樣細胞對大鼠脊髓損傷的修復作用。方法 以載GDNF基因的重組腺病毒轉染BMSCs以誘導其分化。選取36只SD大鼠制成脊髓損傷模型，隨機分成3組。對36只大鼠于造模后1、2、3、4周行BBB評分，并于造模后第4周取材行HE染色及免疫組化染色，觀察脊髓損傷修復情況。結果 載GDNF基因重組腺病毒轉染后, BMSCs可持續、穩定表達較高水平的GDNF, 并能成功誘導BMSCs向神經元樣細胞分化。術后1～4周, C組BBB評分均明顯高于其他2組, A組最低且無明顯變化; 術后4周HE染色結果顯示, A組脊髓空洞面積最大, C組空洞面積最小; 術后4周, A組脊髓損傷部位出現少量NF200、GFAP陽性細胞, C組較B組和A組則明顯增多。結論 GDNF基因修飾的BMSCs能成功分化為神經元樣細胞，移植后對大鼠脊髓損傷具有一定的修復作用。

脊髓損傷; 骨髓間充質干細胞; 膠質細胞源性神經營養因子

脊髓損傷是一種嚴重的神經系統疾病，可引起軸突損傷以及大量的神經細胞死亡[1], 造成患者感覺和運動功能的喪失[2]。傳統的手術、藥物、物理療法雖然可以在短期內提高患者的生活質量，但并不能促進損傷神經的修復及其功能的恢復[3]。隨著組織工程的不斷發展，細胞移植為治療脊髓損傷提供了一條新的途徑，其中骨髓間充質干細胞是理想的種子細胞。已有研究[4-5]證實，骨髓間充質干細胞可以通過分化成為神經細胞替代受損組織、分泌神經保護性營養因子、減輕炎癥反應、促進軸突再生及重建神經通路等途徑促進脊髓損傷動物模型神經功能的恢復。但由于受損傷后炎癥、氧自由基等的影響，移植后的細胞分化并不理想，直接應用骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷的效果是有限的[6]。因此，體外促進BMSCs向神經樣細胞分化在脊髓損傷的治療中有重要的研究價值。本實驗以GDNF基因修飾BMSCs, 于體外誘導其分化為神經元樣細胞后移植治療脊髓損傷大鼠，對其療效進行觀察并對比研究局部移植和靜脈移植兩種移植途徑的療效，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

實驗動物: 180 g Wister大鼠，購自揚州大學實驗動物中心; 病毒，載膠質細胞源性神經營養因子和綠色熒光蛋白基因重組腺病毒(AD-rGDNF-GF)由揚州大學醫學院生化實驗室進行構建和擴增; DMEM培養基; 超凈工作臺; CO2培養箱; 石蠟切片機; 熒光顯微鏡。

1.2 BMSCs的分離與培養

收集實驗大鼠股骨骨髓于離心管中，以1 000 r/min離心10 min, 取沉淀，以含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMED重懸后于5%CO2、37 ℃培養箱中孵育48 h。之后每3～4 d更換1/2體積培養液，顯微鏡觀察當細胞達80%融合后，以胰酶消化貼璧細胞并傳代培養。取第3代細胞檢測CD34、CD44、CD45、CD90分子的表達情況，行BMSCs鑒定。

1.3 體外轉染

將BMSCs以5×104/孔的密度種植于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞貼壁后用胰酶消化細胞。向各孔中加入無血清DMEM和重組腺病毒懸液，共2 mL, 使感染復數MOI為100。于恒溫培養箱中孵育2 h后更換培養液為含10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養。轉染后應用倒置熒光顯微鏡觀察轉染情況, Western Blot法檢測GDNF的表達，免疫熒光鑒定Neun、Nfl的表達。

1.4 動物分組及大鼠脊髓損傷模型的制備

將48只大鼠隨機分為實驗分為3組, A組為模型組, B組為靜脈移植組, C組為局部移植組。采用改良Allen′s打擊法[7]制作動物脊髓損傷模型。以0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠。以T12棘突為中心，從背部正中切開皮膚，逐層暴露皮下組織，分離椎旁組織、顯露T11～L1棘突和椎板。去除T12椎板和棘突，顯露脊髓。以10 gcf致傷能量打擊脊髓，造成脊髓損傷。以大鼠軀體抖動、雙后肢回縮樣撲動以及尾巴痙攣性擺動為造模成功標準。

1.5 運動功能評分

參照BBB評分標準，分別于術后當天及術后1、2、3、4周對各組大鼠行運動功能評分。

1.6 免疫熒光

制作細胞爬片，置于5%CO2、37 ℃培養箱培養。取細胞爬片，用4%多聚甲醛固定10 min, PBS漂洗5 min; 0.5%Triton穿孔15 min, PBS漂洗2次，每次5 min; 1%胎牛血清封閉30 min; 加入稀釋的一抗，置于4 ℃冰箱過夜; PBS漂洗2次，每次5 min; 加入稀釋的二抗，置于室溫雜交2 h; PBS漂洗2次，每次5 min; 5 μg/mL DAPI染色2 min; 抗淬滅封片劑封片備用。

1.7 HE染色

取實驗動物損傷區脊髓制成切片備用。蘇木素染色5 min, 自來水沖洗去除殘留染色液; 鹽酸酒精分化30 s, 沖洗; 返藍液返藍5 min, 沖洗; 伊紅水溶液浸染5 min; 梯度乙醇脫水，每級1 min。切片入二甲苯2次，每次約1 min; 滴加適量樹膠封片。

1.8 免疫組化

取實驗大鼠損傷區脊髓制成冰凍切片固定。PBS清洗3次，每次3 min; 加入3%雙氧水室溫孵育10 min; PBS清洗3次，每次3 min; 加入5%山羊血清，室溫孵育20 min; 加入1∶200稀釋的NSE、NF-200抗體, 4 ℃過夜; PBS清洗3次，每次1 min; 加入二抗，37 ℃孵育30 min; PBS清洗3次，每次3 min; DBA染色3～10 min; 蒸餾水清洗2次，每次1 min; 封片。

2 結 果

2.1 轉染結果

載GDNF基因重組腺病毒轉染BMSCs 24 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白GFP的表達，隨著時間的延長熒光蛋白GFP的熒光強度漸增強，轉染7 d后熒光蛋白GFP的表達最強, 14 d后熒光明顯減弱。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察AD-rGDNF-GFP轉染BMSCs后第1、3、7、14天綠色熒光蛋白GFP的表達情況(300倍)

2.2 GDNF蛋白情況

分別于轉染后第1、3、7、14天使用Western Blot法檢測，發現BMSCs可以持續、穩定表達GDNF蛋白。見圖2。

圖2 轉染后應用WesternBlot法檢測GDNF蛋白表達情況

2.3 神經元樣細胞的免疫熒光鑒定

于熒光顯微鏡下鑒定BMSCs向神經元樣細胞分化的結果顯示，轉染3 d后免疫熒光顯微鏡下可觀察到神經元特異性標志物神經元蛋白NeuN的表達，呈紅色。7 d后可觀察到神經絲蛋白NF-L的表達，呈紅色，且細胞呈現典型的神經細胞突觸結構。見圖3。

2.4 BBB評分結果

造模后大鼠雙下肢立即癱瘓, BBB評分為0。術后1～4周，A、B、C組BBB評分均有不同程度的提高，但B、C組較A組顯著明顯(P<0.05)。術后1周，局部移植組C組與靜脈移植組B組BBB評分比較無顯著差異(P>0.05); 術后2～4周, B、C組評分出現逐漸增高趨勢, C組評分增高較B組顯著(P<0.05)。見表1。

圖a、b、c為熒光顯微鏡下NeuN熒光染色結果;圖d、e、f為熒光顯微鏡下NF-L熒光染色結果(300倍)圖3 熒光顯微鏡下觀察BMSCs體外誘導后神經元標志物熒光染色情況

2.5 脊髓HE染色結果

術后4周脊髓組織HE染色顯示, A、B、C組均有不同程度的脊髓損傷。A組脊髓空洞面積最大, C組脊髓空洞面積明顯小于B組。見圖4。

圖a為A組脊髓HE染色結果;圖b為B組脊髓HE染色結果;圖c為C組脊髓HE染色結果(60倍)圖4 顯微鏡下觀察移植后4周脊髓HE染色結果

2.6 脊髓免疫組化結果

術后4周免疫組化顯示, 3組脊髓均有不同程度的NF-200、GFAP陽性細胞形成，其中A組最少，C組脊髓損傷局部NF-200、GFAP陽性細胞明顯多于A、B組。見圖5。

圖a、b、c分別為A、B、C組NF-200脊髓免疫組化結果;圖d、e、f分別為A、B、C組GFAP脊髓免疫組化結果(600倍)圖5 顯微鏡下觀察移植后4周脊髓GFAP免疫組化結果

表1 各組大鼠不同時間點BBB評分比較

與A、B組比較, *P<0.05; 與A組比較, #P<0.05。

3 討 論

骨髓間充質干細胞是一類具有多向分化潛能和自我更新能力的干細胞，在特定的條件下，可以分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經元樣細胞等[8]。其由于具有易于分離、培養且移植不受倫理道德的約束等有點，被廣泛應用于脊髓損傷模型的研究。Woodbury等[9]在體外用二甲基亞砜和丁基羥基茴香醚成功誘導骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞，并表達神經元特異性烯醇化酶(NSE)，這表明BMSCs可以向神經元樣細胞分化。已有研究[10]證實, BMSCs分化的神經元樣細胞有利于促進脊髓損傷的修復，而移植神經元樣細胞治療脊髓損傷的關鍵在于促進移植細胞在受損局部的存活及神經通路的重建。

作者的前期研究[11]發現, BMSCs在GDNF的誘導下可以向神經樣細胞分化，并能穩定表達神經元特異性標志物，但依靠外源性GDNF誘導分化的作用不穩定，難以持續且成本較高。本研究通過載以GDNF基因的重組腺病毒載體轉染BMSCs, 以期通過BMSCs自身持續、穩定表達的GDNF蛋白誘導其分化。于構建AD-rGDNF-GFP載體轉染BMSCs 3 d后通過倒置熒光顯微鏡可觀察到BMSCs中綠色熒光蛋白GFP高效表達，提示有較高的轉染效率。通過Western blot法檢測發現，轉染后的BMSCs可以持續、穩定表達GDNF蛋白，并能維持其較高的濃度。應用免疫熒光檢測發現神經元標志物NeuN、NF-L均有表達，表明BMSCs已成功分化為神經元樣細胞。作者還通過RT-PCR檢測發現，GDNF誘導后BMSCs中的神經營養因子BDNF、NT-3等表達顯著增加，而這些神經營養因子在脊髓損傷后的神經再生中起著重要的作用[12]。

GDNF屬于TGF-β超家族，是一種生物活性很強的細胞因子，在體內分布廣泛，它能促進神經細胞存活、神經細胞軸突再生以及突觸形成，并對神經元有著重要的保護作用[13]。有研究[14]發現, GDNF可以通過改善局部缺血以及減少少突細胞的細胞凋亡等途徑提升脊髓損傷大鼠的后肢運動功能，對脊髓損傷的修復具有一定的作用。

本實驗通過病毒轉染的方法將載有GDNF基因的腺病毒載體導入BMSCs中，誘導其向神經元樣細胞分化，并將分化后的BMSCs移植入脊髓損傷的大鼠體內來研究其對脊髓損傷的修復作用。運動功能評分是評價脊髓損傷神經功能恢復的重要指標[15]。本研究分別于造模后1、2、3、4周對實驗大鼠進行BBB評分，結果顯示術后1～4周, A、B、C組BBB評分均有不同程度的提高，但B、C組較A組顯著提高(P<0.05)。術后1周，局部移植組C組與靜脈移植組B組BBB評分比較無顯著差異(P>0.05); 術后2～4周, B、C組評分出現逐漸增高趨勢, C組評分增高較B組顯著(P<0.05)。NF-200主要存在于軸突中，它的表達增高表示神經元以及軸突的再生和生長，有利于大鼠神經功能的恢復[16]。GFAP被認為是膠質細胞的標志性蛋白，其表達量的增加表明膠質細胞的形成。研究[17-18]認為，在脊髓損傷前期其表達量的增加有利于脊髓損傷的修復，這可能與其分泌的神經營養因子有關; 在脊髓損傷后期其表達量的增加會阻礙神經軸突形成，不利于脊髓損傷的修復。術后4周脊髓組織免疫組化3組脊髓均有不同程度的NF-200、GFAP陽性細胞形成，其中A組最少, C組脊髓損傷局部NF-200、GFAP陽性細胞明顯多于A、B組。本實驗在大鼠脊髓損傷模型的治療上取得了一定的療效，推測其機制可能為: ① 分化后的BMSCs細胞通過替代已損傷的神經細胞發揮修復脊髓損傷的作用; ② 6BMSCs細胞分泌的神經營養因子促進了脊髓損傷修復; ③ 持續表達的GDNF對損傷的脊髓具有一定的修復作用。

目前，研究移植BMSCs治療脊髓損傷常用的方法主要有局部注射移植、經靜脈移植、經蛛網膜下腔移植等。本實驗選取局部移植和經靜脈移植兩種方法進行比較研究，發現局部移植組的BBB評分明顯高于靜脈移植組，這可能與到達損傷部位的細胞數量有關[19]。雖然在脊髓損傷時BMSCs具有一定的向損傷部位遷移的特性[20], 但是由于脾、肺、肝等器官的“首關效應”，使得通過靜脈移植的細胞大量死亡，達到損傷部位的細胞很少[21]。本實驗結果顯示局部移植組的療效優于靜脈移植組，但有學者[22]認為局部移植本身具有一定的創傷性，會加重局部組織的損傷。比較而言，靜脈移植是一種無創的治療方法，不會造成損傷部位的二次損傷，但是由于首關效應造成了大量移植細胞的死亡，其對脊髓損傷的修復效果并不理想。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells modified by GDNF in transplantation treatment of patients with spinal cord injury

WU Lang, HUANG Cheng, FENG Xinming, BI Songchao, CHEN Tao, WANG Peng, YANG Jiandong

(ClinicalMedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225000)

Objective To observe the effectiveness of transplantation of neuron-like cells induced by GDNF from BMSCs on treatment of spinal cord injury in rats. Methods Transfected BMSCs by recombinant adenovirus containing the gene of rGDNF and GFP. 36 SD rats with spinal cord injury were randomly divided into three groups. All the 36 SD rats with spinal cord injury were scored by the Basso, Beattle, Bresnahan locomotor rating scale at different time points (1、2、3、4 weeks after operation). In the 4thweek after operation, tissue from the injury section was prepared to observe repair of spinal cord injury. Results BMSCs was able to secrete GDNF continuously after transfected by recombinant adenovirus containing the gene of rGDNF and GFP. After operation, BBB scores in intralesional treatment group significantly increased when compared with that of intravenous treatment group and injury control group. In the 4thweek after operation, HEmatoxylin-eosin staing results showed that cavitation in intravenous treatment group was larger than that in intralesional treatment group with the one of injury control group being the biggest. Immunohistochemical method showed that there were more NF200+cells and GFAP+cells in intralesional treatment group than in the other two groups, and injury control group had the least NF200+cells and GFAP+cells. Conclusion After induced into nuron-like cells, BMSCs can treat spinal cord injury effectively.

spinal cord injury; bone marrow mesenchymal stem cells; Gial cell line-derived neurotrophic factor

2016-12-14

國家自然科學基金面上項目資助項目(81071466); 江蘇省六大人才高峰資助項目(2014-WSN-076)

楊建東, E-mail: yangjiandong69@sohu.com

R 744

A

1672-2353(2017)09-094-05

10.7619/jcmp.201709024