貝那普利對肝纖維化大鼠Ang-(1-7)、ACE2及Mas受體mRNA的影響

丁少華，申鳳俊，王麗華

（山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院消化內(nèi)科，山西 太原 030001）

貝那普利對肝纖維化大鼠Ang-(1-7)、ACE2及Mas受體mRNA的影響

丁少華，申鳳俊，王麗華

（山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院消化內(nèi)科，山西 太原 030001）

目的 觀察血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)貝那普利抗大鼠肝纖維化的療效，研究貝那普利對肝纖維化大鼠肝組織血管緊張素-（1-7）[Ang-(1-7)]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）mRNA及Mas受體mRNA的影響。方法制備四氯化碳(CCl4)誘導的大鼠肝纖維化模型，同時應用貝那普利灌胃，共8w。對肝組織進行常規(guī)HE及Masson染色，ELISA測定肝勻漿血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、Ang-(1-7)濃度，計算AngⅡ/Ang-(1-7)比值，實時熒光定量PCR測定肝組織ACE2mRNA和Mas受體mRNA的水平。結(jié)果造模6、8周末，貝那普利治療組大鼠的肝纖維化程度均較模型組減輕；肝勻漿AngⅡ的濃度較模型組降低（P＜0.05)，肝勻漿Ang-(1-7)的濃度較模型組增加（P＜0.05)，肝勻漿AngⅡ/Ang-(1-7)的比值較模型組降低（P＜0.05)；貝那普利治療組肝組織ACE2及Mas受體mRNA的水平均較模型組增加（P＜0.05)。結(jié)論貝那普利具有良好的抗肝纖維化作用，其機制可能與AngⅡ濃度降低，Ang-(1-7)濃度增加，AngⅡ/Ang-(1-7)比值降低有關，亦可能與ACE2和Mas受體表達增加有關。

肝纖維化；貝那普利；AngⅡ；Ang-(1-7)；ACE2；Mas受體

腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)。心臟、腎臟局部RAS的激活，是導致組織損傷后心、腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的主要因素，抑制RAS活性可顯著抑制心、腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[1-2]。研究表明，肝臟局部存在的RAS亦與肝纖維化密切相關。傳統(tǒng)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）-AngⅡ-血管緊張素Ⅱ1型受體（angiotensinⅡ receptor type1 AT1R）軸通過AngⅡ與其相應受體AT1R結(jié)合，促進肝星狀細胞的激活和細胞外基質(zhì)的合成。ACE2-Ang-(1-7)-Mas為RAS系統(tǒng)新發(fā)現(xiàn)的作用軸，Ang-(1-7)與其特異性的Mas受體結(jié)合，發(fā)揮拮抗AngⅡ/AT1R的生物學作用，進而保護肝纖維化[3]。貝那普利為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥，該藥特點為出現(xiàn)作用慢，但維持作用時間長。既往大鼠肝纖維化模型實驗證實貝那普利有良好的抗肝纖維化作用，本研究欲進一步觀察貝那普利對肝纖維化大鼠肝組織Ang-(1-7)濃度的影響，以及從分子生物學水平研究貝那普利對肝纖維化大鼠肝組織ACE2和Mas受體表達的影響。進一步探究貝那普利抗肝纖維化的作用機制，期望為臨床肝纖維化以及肝硬化的治療提供新思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心；CCL4購自天津傲然精細化工研究所；鹽酸貝那普利片購自成都地奧制藥集團有限公司；Masson三色染色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；大鼠Ang-(1-7)、AngⅡELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；凍存液購自北京萊索寶科技有限公司；TRIzol裂解液、氯仿、異丙醇、0.25%胰蛋白酶、隨機引物、dNTP、ROX（FastStart Universal SYBR Green Master）、引物、Buffer、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶均購自上海生工生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備：將購回的清潔級健康雄性SD大鼠在生理實驗室正常飲食1周，以適應環(huán)境。7 d后將大鼠隨機分為正常對照組（12只），模型組（14只），貝那普利治療組（14只）。除正常對照組外，其余兩組大鼠均皮下注射40% CCL4油劑，2次/w，首次注射劑量為5 mL/kg，之后為2 mL/kg，正常對照組始終給予相同劑量油劑皮下注射。與此同時，貝那普利治療組于造模第1天起每天給予10 mg/kg的貝那普利灌胃，其余兩組給予相同劑量生理鹽水灌胃，至實驗結(jié)束。于實驗6、8周末處死3組大鼠各6只，留取肝組織備用。模型組與貝那普利組大鼠造模過程中各死亡2只大鼠。

1.2.2 獲取標本：大鼠處死前禁食12小時，用25%烏拉坦（4 ml/1kg)腹腔注射麻醉妥后，無菌操作打開腹腔，觀察肝臟大小、色澤、質(zhì)地，有無結(jié)節(jié)。取肝左葉組織適量用10%甲醛溶液固定，取2塊適宜大小的肝左葉組織于凍存管中，保存于-80℃冰箱。

1.2.3 肝組織病理染色：將包埋好的肝組織蠟塊以2～3μm厚度切片，常規(guī)HE染色，按照Masson染色試劑盒說明書進行Masson染色。封片后置于光學顯微鏡下觀察。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)測定肝勻漿AngⅡ、Ang-(1-7)含量：按照AngⅡ、Ang-(1-7)ELISA試劑盒說明書測出吸光值，應用計算機軟件根據(jù)標本吸光值計算出相應的AngⅡ、Ang-(1-7)含量。

1.2.5 Real-time PCR測定肝組織ACE2 mRNA、Mas受體mRNA的水平：用Trizol法抽提取肝組織總RNA。應用分光光度計測定，計算出總RNA的濃度及純度，純度在0.18～0.21則表示總RNA的純度較好。繼而根據(jù)Fermentas K 1622反應體系進行逆轉(zhuǎn)錄，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肍astStart Universal SYBRGreen Master(ROX)反應體系進行定量測定。內(nèi)參Beta-actin上游：5'-gtcaggtcatc actatcggcaat-3'，下游：5'-agaggtctttacggatgtcaacgt-3'，產(chǎn)物長度為147bp。ACE2上游：5’-gctaaacatgatggcccact-3’，下游：5’-cccacagtcgaattcctgtt-3’，長度為218bp。Mas受體上游：5’-ctctcggctttgtggagaac-3’,下游：5’-ggcctgtgttgtagccaaat-3’,長度為228bp。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)，計量資料采用“±s”表示，符合正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗行單因素方差分析，不符合上述條件者行 Kruskal-Wallis秩和檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況比較 正常對照組大鼠精神、活動、飲食良好，毛色光澤正常，體質(zhì)量隨實驗時間延長逐漸增加。模型組大鼠從造模第3周開始出現(xiàn)飲食、活動量減少，毛色黯淡,體質(zhì)量增長較對照組緩慢。貝那普利組大鼠活動、食欲、毛色光澤較模型組好。造模6周末模型組大鼠開始出現(xiàn)體質(zhì)量下降。

2.2 組織病理學變化 HE和Masson三色染色后，采用改良Knodell評分標準評估肝纖維化程度；（1）正常對照組肝小葉結(jié)構正常，肝細胞索排列整齊，肝細胞無病變。（2）造模6 w：模型組和貝那普利組肝細胞變性、壞死、脂變嚴重，模型組肝內(nèi)有明顯纖維間隔形成。（3）造模8 w：貝那普利組肝細胞變性、壞死、脂變進一步加重，肝內(nèi)出現(xiàn)少量的纖維間隔；模型組已形成穩(wěn)定的完全性中心-中心和(或)中心-門靜脈性纖維間隔并存的肝纖維化。

2.3 大鼠肝勻漿AngⅡ、Ang-(1-7)濃度及AngⅡ/Ang-(1-7)比值 （1）6、8周末，模型組大鼠肝勻漿AngⅡ濃度較正常對照組明顯增高（P＜0.01),貝那普利組較模型組降低（P＜0.05)。見表1。 6周、8周末，模型組肝勻漿Ang-（1-7）濃度較正常對照組明顯增高（P＜0.01),貝那普利組較模型組進一步增高（P＜0.05)。見表1。

表1 肝勻漿AngⅡ、Ang-(1-7)濃度變化（±s，ng/mL)Table 1 Changes of Ang Ⅱ and Ang-(1-7)in Liver Homogenate(±s,ng/mL)

表1 肝勻漿AngⅡ、Ang-(1-7)濃度變化（±s，ng/mL)Table 1 Changes of Ang Ⅱ and Ang-(1-7)in Liver Homogenate(±s,ng/mL)

注:與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05

F值80.200 99.034 255.682 221.526時間6周8周指標AngⅡAng-(1-7) AngⅡAng-(1-7)對照組（n=6）23.330±1.606 40.008±2.268 23.261±1.482 40.097±1.497模型組（n=6）42.649±4.337a53.720±2.660a48.626±1.357a59.660±2.774a貝那普利組（n=6）39.163±1.547b57.260±1.695b45.518±3.072b62.358±1.295b

（2）6、8周末，模型組大鼠肝勻漿AngⅡ/Ang-(1-7)比值較正常對照組增高（P＜0.01),貝那普利預防治療組較模型組降低（P＜0.05)。見表2。

表2 肝勻漿AngⅡ/Ang-(1-7)比值變化（±s）Table 2 Changes ofAngⅡ/Ang-(1-7)Ratio in Liver Homogenate (±s)

表2 肝勻漿AngⅡ/Ang-(1-7)比值變化（±s）Table 2 Changes ofAngⅡ/Ang-(1-7)Ratio in Liver Homogenate (±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

F值21.703 48.292時間6周8周對照組（n=6）0.585±0.043 0.581±0.042模型組（n=6）0.794±0.073a0.816±0.043a貝那普利組（n=6）0.684±0.044b0.732±0.041b

2.4 大鼠肝組織ACE2 mRNA、Mas受體mRNA的水平 6、8周末模型組大鼠肝組織ACE2 mRNA、Mas受體mRNA水平較對照組增加（P＜0.05）；那普利組大鼠肝組織ACE2mRNA、Mas受體mRNA含量較模型組進一步增加（P＜0.05)。見表3、表4。

表3 大鼠肝組織ACE2 mRNA水平（±s）Table 3 The level ofACE2 mRNAin rat liver(±s)

表3 大鼠肝組織ACE2 mRNA水平（±s）Table 3 The level ofACE2 mRNAin rat liver(±s)

注:與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

F值61.186 281.101時間6周8周對照組（n=6）1.189±0.184 1.232±0.148模型組（n=6）2.284±0.322a2.813±0.290a貝那普利組（n=6）3.400±0.471b4.015±0.146b

3 討論

病毒、酒精、藥物、毒物、自身免疫等因素導致的肝臟炎癥或損傷，在其修復過程中，可代償性引起肝纖維化。肝纖維化是慢性肝病進展為肝硬化的關鍵階段。作為RAS為人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，近年研究顯示,肝臟內(nèi)局部RAS系統(tǒng)與肝纖維化形成密切相關[4-5]。經(jīng)典的ACE-AngⅡ-AT1R軸促進HF的發(fā)生發(fā)展，AngⅡ是該軸核心效應分子，研究者提出肝臟局部的AngⅡ持續(xù)增高，對肝纖維化起更重要的調(diào)節(jié)作用。目前已經(jīng)通過研究證實ACEI和ARB藥物有良好的抗肝纖維化作用[5-7]。近期氯沙坦已被進一步用到改善肝纖維化的臨床試驗觀察，且研究顯示纈沙坦可使肝硬化患者肝纖維化指標下降，肝功能改善[8-9]。ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸為RAS系統(tǒng)新發(fā)現(xiàn)的作用軸，在體內(nèi)外可拮抗AngⅡ的活性,發(fā)揮舒張血管、降低血壓、利尿、抑制成纖維細胞增殖等作用。

表4 大鼠肝組織Mas受體 mRNA水平（±s)Table 4 Expression of Mas Receptor mRNAin Rat Liver Tissue (±s)

表4 大鼠肝組織Mas受體 mRNA水平（±s)Table 4 Expression of Mas Receptor mRNAin Rat Liver Tissue (±s)

注:與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

F值124.685 129.572時間6周8周對照組（n=6）0.378±0.071 0.378±0.072模型組（n=6）3.734±0.483a6.000±1.103a貝那普利組（n=6）8.132±1.394b11.984±1.860b

本研究結(jié)果顯示，大鼠肝纖維化模型組AngⅡ、Ang-(1-7)濃度及Mas受體mRNA含量均較正常對照組增加，證實了肝纖維化形成過程中AngⅡ/ATIR及Ang-(1-7)/Mas均被激活。李旭等[10]通過給膽管結(jié)扎大鼠持續(xù)腹腔注射Ang-（1-7），得出Ang-(1-7)治療組肝纖維化評分、膠原面積、肝星狀細胞α-SMA的表達較膽管結(jié)扎組顯著減少。另有研究者發(fā)現(xiàn)Mas受體拮抗劑A779可阻斷膽管結(jié)扎肝纖維化大鼠Ang-(1-7)的作用使轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β1）水平增高，加重肝纖維化；而Mas受體特異性激動劑則可以降低TGF-β1蛋白及其mRNA的表達，減輕肝纖維化程度。本研究結(jié)果顯示，貝那普利治療組肝組織AngⅡ濃度較模型組降低，Ang-(1-7)濃度及Mas受體mRNA含量較模型組增加，提示貝那普利不僅抑制肝組織AngⅡ的生成，而且可能通過增加Ang-(1-7)濃度以及Mas受體的表達，從而發(fā)揮抗肝纖維化效應。

Vilas-Boas等[11]研究發(fā)現(xiàn)Ang-(1-7)/AngⅡ在輕-中度肝病患者中會增高，考慮Ang-(1-7)與AngⅡ之間的平衡在肝纖維化發(fā)病機制中扮演重要角色。申鳳俊等通過臨床試驗[12]研究正常人、慢性乙肝患者、肝硬化患者的AngⅡ/Ang-(1-7)比值變化，結(jié)果顯示肝硬化組AngⅡ/Ang-(1-7)比值較慢性乙肝組增高，得出AngⅡ/Ang(1-7)比值越高，肝纖維化程度越重，患者病情亦越重。本實驗結(jié)果：模型組大鼠AngⅡ/Ang(1-7)比值較對照組增高，與以往研究一致。貝那普利預防治療組大鼠6、8 w末AngⅡ/Ang-(1-7)比值均較模型組降低，且肝纖維化程度較模型組亦減輕。由于Ang-(1-7)在ACE催化作用下會轉(zhuǎn)化為無活性的Ang-（1-5），貝那普利可抑制ACE作用，進而抑制Ang-(1-7)的降解，表現(xiàn)為增加Ang-(1-7)的濃度。因此我們考慮貝那普利可能通過抑制AngⅡ的生成，且增加Ang-(1-7)的濃度，表現(xiàn)為降低AngⅡ/ Ang-(1-7)比值,從而阻止肝纖維化的進展。

正常肝臟中，ACE2表達很少，慢性肝損傷導致肝纖維化時，ACE2在基因和蛋白水平均表達增加。本研究結(jié)果顯示，模型組ACE2 mRNA含量較正常對照組增加，與以上研究結(jié)論相似。ACE2被認為是慢性肝損傷的負性調(diào)節(jié)劑，具有抗肝纖維化作用。Osterreicher等[13]在實驗中將小鼠的ACE2基因敲除，發(fā)現(xiàn)敲除ACE2基因的小鼠比野生小鼠表現(xiàn)出更嚴重的肝纖維化。應用ACE2重組體進行治療，可明顯減輕慢性肝損傷導致的肝纖維化。Huang等[14]研究認為ACEI可使肝組織ACE2表達增加，但也有研究者認為ACEI對ACE2表達無明顯影響。本研究結(jié)果顯示，貝那普利組肝組織ACE2 mRNA含量較肝纖維化模型組增高，這與Huang等[14]的研究一致。

綜上所述，本研究認為在病因刺激下肝臟局部ACE-AngⅡ-AT1R軸和ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸均被激活，在一定時間段內(nèi)兩軸調(diào)節(jié)作用維持動態(tài)平衡，隨著有害因素持續(xù)存在或加重，最終在ACE-AngⅡ-AT1R軸作用下促使肝纖維化甚至肝硬化的發(fā)生。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑貝那普利可能通過抑制AngⅡ的生成，增加Ang-(1-7)的濃度，使AngⅡ/Ang-(1-7)比值降低，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。亦可能通過使ACE2、Mas受體表達增加，從而延緩肝纖維化的進程。本研究有望對臨床尋求肝纖維化新的治療方法提供進一步的實驗依據(jù)。

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Effects of Benazepril onAng-(1-7)and mRNAof ACE2 and Mas receptor in rats with hepatic fibrosis

Ding Shao-hua,Shen Feng-jun,Wang Li-hua
(Department of Gastroenterology,First Clinical Medical College,Shanxi Medical University,Taiyuan,Shanxi,030001,China)

Objective To observe the curative effect of angiotensin converting enzyme inhibitor benazepril in the treatment of liver fibrosis,to study the effect of benazepril on the expression ofAng-(1-7)and concentration of mRNAofACE2 and Mas receptor in liver tissue of rats with hepatic fibrosis.MethodsThe rat model with hepatic fibrosis was induced by carbon tetrachloride(CCl4),meanwhile rats in treatment group were given benazepril for eight weeks by gastric gavage.The liver tissue was done with hematoxylin-eosin(HE)and Masson trichroe staining.The concentration of AngⅡand Ang-(1-7)was determined by enzyme linked immunosorbent assaynd enzyme linked immunosorbent assay.The level of mRNA of ACE2 and Mas receptor in liver tissue was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.ResultsAt sixth and eighth weeks of the experiment,the degree of hepatic fibrosis in benazepril treated group was lower than that in model group;the concentration of Ang II of liver homogenate in the treatment group than those in the model group decreased(P＜0.05),the concentration of Ang-(1-7)of liver homogenate in the treatment group than those in the model group increased(P＜0.05),the ratio of Ang II/Ang-(1-7)of liver homogenate in the treatment group than those in the model group decreased(P＜0.05);the level of mRNA of ACE2 and Mas receptor in the treatment group was significantly higher than that in the model group(P＜0.05).ConclusionBenazepril significantly attenuated the degree of hepatic fibrosis,and it may by decreasing the concentration of AngⅡ，increasing the concentration of Ang-(1-7),that is Ang II/Ang-(1-7)ratio decreased,and may also associated with increased expression of ACE2 and Mas receptor.

Liver fibrosis;Benazepril;Ang II;Ang-(1-7);ACE2;Mas receptor

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.15.007