白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠的保護作用及機制研究

袁錚

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·論著·

白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠的保護作用及機制研究

袁錚

目的 研究白藜蘆醇(resveratrol，Res)對腎臟缺血再灌注損傷大鼠的保護作用并探討其可能的作用機制。 方法 采用夾閉雙側腎蒂血管45分鐘的方法建立缺血再灌注腎損傷大鼠模型并給予不同劑量白藜蘆醇低、中、高劑量[10、20、40 mg/(kg·d)]和銀杏葉提取物[100 mg/(kg·d)]進行干預治療(療程14天)，并另設模型組和假手術組。計算腎臟指數，生化分析法測定血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinin，SCr)、尿酸(uric acid，UA)含量，HE染色法觀察腎臟組織形態結構改變；比色法檢測腎臟組織中抗氧化酶活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)；TUNEL法觀察細胞凋亡狀況。 結果 與模型組比較發現白藜蘆醇中劑量[20 mg/(kg·d)]組、白藜蘆醇高劑量[40 mg/(kg·d)]組大鼠腎臟指數顯著降低，血清BUN、SCr、UA含量均顯著降低；腎臟組織病變明顯改善，以白藜蘆醇高劑量組最為顯著；抗氧化酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(cata-lase，CAT)活性顯著升高且MDA含量顯著降低，其中白藜蘆醇高劑量組谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性顯著升高；腎臟組織細胞凋亡狀況明顯改善、白藜蘆醇中、高劑量組凋亡指數(apoptosis index，AI)顯著降低；上述差異均具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。 結論 白藜蘆醇能夠通過抑制氧化應激和細胞凋亡而對腎臟缺血再灌注損傷大鼠起到一定的保護作用。

白藜蘆醇； 腎臟缺血再灌注； 凋亡； 炎癥； 氧化應激

腎缺血再灌注損傷是臨床上腎臟手術、失血、休克時常見并發癥，其病理機制非常復雜，其中氧化應激損傷以及繼發性細胞凋亡是腎缺血再灌注損傷的重要病理機制[1]，這也為研究新型治療藥物提供了思路；既往研究發現，藥物抑制氧化應激反應和細胞凋亡對腎缺血再灌注大鼠具有一定的保護作用[2-3]；白藜蘆醇(resveratrol，Res)是存在于多種植物中的天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗凋亡等藥理學作用[4-5]。但白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠是否具有保護作用尚未見文獻報道，本研究通過夾閉雙側腎蒂血管45分鐘建立缺血再灌注腎損傷大鼠模型并給予不同劑量白藜蘆醇進行干預治療，研究白藜蘆醇對缺血再灌注腎損傷大鼠的保護作用并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

白藜蘆醇(陜西慧科植物開發有限公司，純度≥98%，批號：140516)；銀杏葉提取物(湖南長沙惠瑞生物科技有限公司，批號：1408712)；尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinin，SCr)、尿酸(uric acid，UA)試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司(批號：150917012、151205009、150825017)；HE試劑盒、TUNEL試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司(批號：160114、151128)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)均購自南京建成生物工程研究所(批號：20150719、20151008、20150524、20160113)。1.2 實驗動物

實驗用SPF級雄性SD大鼠，120只，7周齡，體重180～220 g，購自河北省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.3 動物模型的制備與分組

參照Chatterjee PK等[6]報道的實驗方法：通過剝離并用無創動脈夾夾閉雙側腎蒂血管45分鐘后松夾的方法建立腎缺血再灌注損傷大鼠模型，夾閉雙側腎蒂血管后腎臟組織變為暗紅色而松夾后逐漸變回鮮紅色，即可認定成功。選取100只模型大鼠隨機分為模型組、白藜蘆醇低、中、高劑量[10、20、40 mg/(kg·d)]組和銀杏葉提取物組[100 mg/(kg·d)][7]，每組各20只。另取20只同齡大鼠作為假手術組，假手術組大鼠行手術通路但不夾閉腎蒂血管。各治療組于再灌注后立即通過腹腔注射給藥，療程2周，模型組和假手術組分別同步給予等體積的生理鹽水。1.4 腎臟指數的計算

稱量體質量，麻醉后取腎臟組織并稱量左側腎臟組織重量，腎臟指數計算公式：腎臟指數=左側腎臟重量/體重

1.5 血清腎功能指標檢測

實施麻醉后經腹主動脈取血并離心，1500 r/min，10分鐘，取上清，由生化分析儀測定各組大鼠血清BUN、SCr、UA含量。

1.6 腎臟組織形態結構改變的觀察

取1.4稱量后的左腎，經4%的多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、展片和脫蠟水化處理后，行常規蘇木精—尹紅(HE)染色，然后通過光學顯微鏡觀察各組大鼠腎臟組織形態結構改變。

1.7 腎臟組織中抗氧化酶活性及MDA含量測定

參照1.4方法取右側腎臟組織，經研磨勻漿處理后離心，3000 r/min，10分鐘，取上清，按照各試劑盒操作方法步驟，采用比色法通過紫外—可見分光度計測定各組大鼠腎臟中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.8 腎細胞凋亡狀況的觀察

取1.6制備的腎臟組織石蠟切片，經脫蠟水化處理后按照TUNEL試劑盒操作方法步驟進行染色處理，通過顯微鏡觀察腎細胞凋亡狀況并照相保存。每張染色切片在相同部位選取互不重疊的5個視野，分別計數每個視野中細胞總數和陽性細胞數，然后計算凋亡指數(apoptosis index，AI)：AI(%)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟指數的影響

模型組大鼠腎臟指數較假手術組顯著升高(P<0.01)；而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經白藜蘆醇中劑量、白藜蘆醇高劑量治療14天后腎臟指數顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷 大鼠腎臟指數的影響 ±s)

注： 與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.2 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎功能監測指標的影響

模型組大鼠血清BUN、SCr、UA含量較假手術組均顯著升高(P<0.01)；而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經白藜蘆醇中劑量、白藜蘆醇高劑量治療14天后血清BUN、SCr、UA含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。2.3 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織形態結構的影響

假手術組大鼠腎臟組織形態結構未見異常；模型組大鼠腎臟組織呈現：腎小球系膜增生、體積增大，細胞空泡變性，間質區淋巴細胞浸潤等明顯的病變；而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經白藜蘆醇治療14天后腎臟組織病變情況明顯改善，以白藜蘆醇高劑量組效果最為顯著。見圖1。

注： A.假手術組；B.模型組；C.白藜蘆醇低劑量組； D.白藜蘆醇中劑量組；E.白藜蘆醇高劑量組； F.銀杏葉提取物組

圖1 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織形態結構的影響(HE×200)

2.4 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中抗氧化酶活性和MDA含量的影響

模型組大鼠腎臟組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性較假手術組顯著降低，而MDA含量顯著升高(P<0.01)；腎臟缺血再灌注損傷大鼠經白藜蘆醇中劑量、白藜蘆醇高劑量治療14天后腎臟組織中抗氧化酶SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，白藜蘆醇高劑量組抗氧化酶GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見表3。

表2 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎功能監測指標的影響±s)

注： 與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表3 白藜蘆醇對模型大鼠腎臟組織中抗氧化酶活性和MDA含量的影響±s)

注： 與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.5 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織細胞凋亡狀況的影響

與假手術組比較發現模型組大鼠陽性著色細胞(凋亡細胞)數量明顯增多，而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經白藜蘆醇治療14天后腎臟組織凋亡細胞數量顯著減少，以白藜蘆醇高劑量組效果最為顯著。見圖2。

注： A.假手術組；B.模型組；C.白藜蘆醇低劑量組； D.白藜蘆醇中劑量組；E.白藜蘆醇高劑量組； F.銀杏葉提取物組

圖2 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織細胞凋亡狀況的影響(TUNEL×400)

模型組大鼠腎臟組織細胞AI較假手術組顯著升高(P<0.01)，而腎臟缺血再灌注損傷大鼠經白藜蘆醇中劑量、白藜蘆醇高劑量治療14天后腎臟組織細胞AI顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表4。

3 討論

近年來，病理生理學研究發現氧化應激以及繼發性細胞凋亡是缺血再灌注損傷重要的病理機制[2-3]，這也為藥物研發提供了新的思路。白藜蘆醇具有抗氧化、抗凋亡等多種藥理學作用[4-5]。本實驗研究發現，經過白藜蘆醇干預治療14天能夠有效降低缺血再灌注腎損傷大鼠腎臟指數，降低血清BUN、SCr、UA含量，改善腎臟組織病變，降低氧化應激損傷，抑制腎臟組織細胞凋亡，提示白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用，其作用機制可能與降低氧化應激損傷和抑制細胞凋亡有關。

表4 白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷 大鼠腎臟組織細胞AI的影響±s)

注： 與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

體內氧自由基(ROS)過剩是氧化應激損傷的病理基礎，常態下ROS的生成與清除處于動態平衡，其中抗氧化酶 (SOD、CAT、GSH-Px)對ROS的清除發揮著重要的催化作用[8-9]；當缺血再灌注后隨著ROS過剩而攻擊細胞膜造成臟器脂質過氧化而生產MDA，因此MDA含量間接反映氧化應激損傷程度[10]。本實驗研究發現：經白藜蘆醇(20～40 mg/kg)干預治療能夠顯著改善腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性并降低MDA含量，提示白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注后氧化應激損傷具有一定抑制作用。

總之，白藜蘆醇對腎臟缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用，其作用機制可能與白藜蘆醇改善抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性、降低氧化應激損傷以及抑制腎臟組織細胞凋亡有關。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Protective effects and mechanism of resveratrol on the rats with renal ischemic-reperfusion injury

YUANZheng.

SeconddepartmentofNephrology，HandanMunicipalCentralHospital，Handan056001，China

YUANZheng，E-mail：hdyuanzheng@163.com

Objective To investigate the protective effects and mechanism of resveratrol (Res) on the rats with renal ischemic-reperfusion injury.Methods The rat models with renal ischemic-reperfusion injury were induced by clipping bilateral renal pedicle vascular for 45min and the rats were treated with Res low-dose, medium-dose and high-dose [10, 20, 40 mg/(kg·d) ] and ginkgo biloba extract [EGb, 100 mg/(kg·d)] for 14d, and set model group and sham operation group. The renal index was calculated; the content of BUN, SCr, UA in serum were determined; the pathological changes of the renal tissue were observed by HE staining; the activity of antioxidase and the content of MDA in renal tissue were determined by colorimetry; the apoptosis of renal cells was observed by TUNEL staining.Results Compared with model group, the renal index in Res medium-dose and high-dose groups were significantly decreased; the content of BUN, SCr, UA in serum were significantly decreased; the pathological changes were significantly improved, especially the Res high-dose treated group; the activity of SOD, CAT in renal tissue were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased, and the activity of GSH-Px in Res 40 mg/(kg·d) group was significantly increased; the apoptosis in Res groups were significantly improved, especially the apoptosis index in Res medium-dose and high-dose treated groups were significantly decreased; all of the difference above were significant(P<0.05,P<0.01).Conclusion Res has protective effects on the rats with renal ischemic-reperfusion injury, which perhaps related to its effects of inhibiting oxidative stress and apoptosis.

Resveratrol; Renal ischemic-reperfusion; Apoptosis; Inflammation; Oxidative stress

056001 邯鄲市中心醫院腎內二科

袁錚(1981- )，女，本科，主治醫師。研究方向：腎疾病相關研究。E-mail：hdyuanzheng@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.008

2016-09-04)