丹皮酚預處理抑制MPP+誘導的BV2小膠質細胞激活的作用研究

王浩 張震中 李中春 趙冰

丹皮酚預處理抑制MPP+誘導的BV2小膠質細胞激活的作用研究

王浩 張震中 李中春 趙冰

目的 探討丹皮酚（Pae）預處理抑制1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）誘導的BV2小膠質細胞激活的作用及機制。方法 以MPP+刺激的BV2小膠質細胞建立帕金森病細胞模型，以不同濃度的Pae預處理BV2小膠質細胞，采用CCK-8、免疫細胞熒光法、ELISA分別檢測BV2小膠質細胞增殖活性、吞噬活性和炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的釋放。結果 與對照組比較，MPP+0.1μmol/L可明顯誘導BV2小膠質細胞的激活，促進BV2小膠質細胞增殖活性、吞噬活性的增強以及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放（均P＜0.01）。與MPP+組比較，MPP++Pae（5、25μmol/L）組預處理后MPP+誘導的BV2小膠質細胞增殖活性、吞噬活性明顯減弱，BV2小膠質細胞釋放的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6明顯減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。 結論 MPP+可誘導BV2小膠質細胞激活，促進細胞增殖、吞噬活性增強以及炎癥因子釋放；經MPP++Pae（5、25μmol/L）預處理后，可抑制以上效應，推測與抑制小膠質細胞吞噬活性及抗炎作用有關。

丹皮酚 帕金森病 小膠質細胞 炎癥因子

帕金森病（parkinson disease，PD）是常見的中樞神經系統退行性疾病，尤其在60歲以上人群中發病率達1%～2%，黑質紋狀體通路多巴胺能神經元的漸進性和選擇性缺失是其主要病理特征[1]。目前PD確切的發病機制尚不清楚，臨床上缺乏控制病程進展的有效治療措施，主要采取對癥治療；因此，深入探討PD發病機制并尋找有效的治療藥物十分迫切[2]。丹皮酚（Pae）是從毛莨科植物牡丹干燥根皮與蘿摩科植物徐長卿中提取的單體，在中樞神經系統的藥理作用十分廣泛[3]。有研究表明Pae對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的PD小鼠具有保護作用[4]；本課題組既往研究表明Pae對魚藤酮、1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）損傷的神經元具有保護作用[5]。小膠質細胞是中樞免疫神經的炎癥細胞，維持神經元微環境的動態平衡。由于小膠質細胞介導的神經炎癥和氧化應激損傷被公認為是PD發病的重要機制[6]，因此，筆者以BV2小膠質細胞為研究對象，探究Pae對MPP+誘導的小膠質細胞激活的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器 BV2小膠質細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；胎牛血清購自中國杭州四季青生物有限公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；MPP+購自美國 Sigma公司；Pae注射液（10mg/2ml）購自中國上海第一生化藥業有限公司，實驗時用DMEM培養液配置，無菌過濾，4℃保存備用；小鼠IL-1βELISA試劑盒購自美國R＆D公司；小鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自中國武漢博士德公司；熒光微球購自美國Inventrogen公司；兔抗 Iba-1抗體購自日本Wako公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗兔IgG抗體購自Millipore公司；CCK-8試劑盒購自中國上海碧云天生物技術有限公司；BX51型倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；Elx800型酶標儀購自美國Bio-TEK公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組處理 BV2小膠質細胞凍于液氮中，實驗時常規復蘇。在37℃、5%CO2的培養箱中，用含10%滅活胎牛血清的高糖型DMEM培養液復蘇，細胞匯集至80%時進行傳代接種，選取對數生長期的細胞進行實驗。實驗分為對照組、MPP+組、MPP++Pae（1、5、25μmol/L）組，共5組。細胞接種于96孔板上，接種密度為1×105/ml；選擇細胞貼壁形態且生長狀態良好者用于實驗；培養24h后加入不同濃度的Pae，在37℃、5% CO2的培養箱內培養1h后；對照組加入培養基，其他4組分別加入含0.1μmol/LMPP+的DMEM培養基，維持至實驗結束。

1.2.2 CCK-8法檢測BV2小膠質細胞增殖活性 取出培養板，每孔加入10μl CCK-8反應液，在5%CO2孵箱中，37℃反應10min后，使用酶標儀檢測450nm處樣品吸光度值（OD450），用于計算細胞增殖活性。

1.2.3 免疫細胞熒光法檢測BV2小膠質細胞吞噬活性 取出培養板，加入熒光微球（直徑1μm）作用1h。實驗完畢當天，0.01mol/L PBS沖洗5min×3次；非免疫羊血清封閉2h，吸干；加入一抗工作液（兔抗人Iba-1抗體，1∶1 000），置于4℃濕盒中孵育過夜。第2天用0.01mol/L PBS沖洗后加入FITC標記的羊抗兔熒光二抗（IgG，1∶200）室溫避光孵育2h，0.01mol/L PBS沖洗后甘油-碳酸鹽緩沖液（含DAPI）封片；熒光顯微鏡下掃描記錄并保存圖像，用于計算BV2小膠質細胞的吞噬指數（PI）。PI=吞噬熒光微球的細胞數/細胞總數×100.00%；吞噬指數越高，表明BV2小膠質細胞的吞噬活性越強。

1.2.4 ELISA檢測炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6釋放水平 收集上清液及細胞，低溫離心后上清液分裝至-40℃冰箱內。按試劑盒說明書檢測炎癥因子的釋放水平；同時，將收集的細胞經蛋白裂解液裂解后，按Bradford法進行蛋白定量分析，測定各蛋白提取液中的蛋白濃度，最后折算為每毫克總蛋白中IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放量。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 預實驗結果 以MPP+誘導BV2小膠質細胞激活建立PD細胞模型，預實驗結果顯示MPP+0.1μmol/L作用24h可明顯誘導BV2小膠質細胞激活，引起細胞形態改變（細胞突起變短，胞體變大變圓）、細胞增殖活性增強。進一步檢測發現MPP+0.1μmol/L作用24h可增強BV2小膠質細胞吞噬功能，促進炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6釋放；隨著MPP+濃度增大，會引起BV2小膠質細胞活性及吞噬功能下降，炎癥因子釋放水平下調。因此，選擇該條件（MPP+0.1μmol/L作用24h）作為誘導BV2小膠質細胞激活改變的條件。

2.2 Pae對MPP+誘導的BV2小膠質細胞增殖活性的影響 與對照組比較，MPP+組小膠質細胞增殖活性明顯升高（P＜0.01）；與MPP+組比較，MPP++Pae（5、25μmol/L）組預處理后小膠質細胞增殖活性明顯降低（均P＜0.05），見表1。

表1 Pae對MPP+誘導的BV2小膠質細胞增殖活性的影響

2.3 Pae對MPP+誘導的BV2小膠質細胞吞噬活性的影響 正常狀態下，吞噬熒光微球的BV2小膠質細胞較少，見圖1a。經MPP+處理后，吞噬熒光微球的BV2小膠質細胞數目明顯增多，見圖1b；與對照組比較，PI明顯增大（P＜0.05）。MPP++Pae（5、25μmol/L）組預處理后，吞噬熒光微球的BV2小膠質細胞數目明顯減少，見圖1d-e；與MPP+組比較，PI均明顯降低（均P＜0.05），見表2。

圖1 Pae對MPP+誘導的BV2小膠質細胞吞噬活性的影響（a：對照組；b：MPP+組；c：MPP++Pae1μmol/L組；d：MPP++Pae 5μmol/L組；e：MPP++Pae 25μmol/L組）

表2 Pae對MPP+誘導的BV2小膠質細胞吞噬活性的影響

2.4 Pae對MPP+誘導的BV2小膠質細胞炎癥因子釋放的影響 經MPP+處理后，BV2小膠質細胞釋放的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6均較對照組明顯增加（均P＜0.05）。與MPP+組比較，MPP++Pae（5、25μmol/L）組預處理后BV2小膠質細胞釋放的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6明顯減少（均P＜0.05），見表3。

表3 Pae對MPP+誘導的BV2小膠質細胞炎癥因子釋放的影響

3 討論

小膠質細胞是腦內的免疫、炎癥效應細胞，對中樞神經系統的損傷十分敏感，其激活先于神經元損傷[7]。正常情況下，小膠質細胞呈分枝狀，通過細長的突起感受周圍微環境的變化并釋放細胞因子、生長因子等，以維持神經元的正常功能。損傷后小膠質細胞迅速激活，形態變為叢、桿狀或阿米巴樣。激活的小膠質細胞受到損傷部位釋放的趨化因子吸引，向損傷部位遷徙增殖；輕度損傷早期，小膠質細胞可釋放IFN-γ、少量的TNF-α和神經營養因子等，參與神經保護作用；損傷較重時，小膠質細胞早期可釋放大量TNF-α、IL-1β等，加重神經損傷；嚴重損傷早期，激活的小膠質細胞可吞噬死亡細胞及其殘片，對損傷的恢復與重建有利，但在大量吞噬的同時，小膠質細胞也會釋放大量ROS、TNF-α、IL-1β等細胞毒性分子，加重神經損傷；可見小膠質細胞具有典型的雙向調節作用[7-9]。

小膠質細胞的激活在PD神經炎癥和多巴胺神經元損傷中起著重要作用。小膠質細胞的異常激活會誘導神經炎癥和氧化應激，并引起神經元損傷；損傷的神經元釋放毒素，又進一步刺激小膠質細胞大量激活，促進小膠質細胞進一步釋放神經毒性因子和免疫因子并且彼此擴大各自毒性，最終引起多巴胺神經元進行性變性死亡，促進PD的發展進程[6,10]。相關研究發現MPTP誘導的PD動物模型中，多巴胺能神經元變性的早期就已經出現明顯的小膠質細胞激活[11]。經MPP+處理的小膠質細胞條件培養液可引起多巴胺能神經元損傷，然而抑制小膠質細胞的激活與減少炎癥因子的釋放可明顯減輕神經元損傷[12]。此外，激活的小膠質細胞發揮的吞噬功能對神經元也有損害作用。在6-羥基多巴或魚藤酮誘導的PD模型中發現黑質多巴胺神經元附近有小膠質細胞吞噬神經元，減弱小膠質細胞的吞噬活性則會減少神經元的丟失[13-14]。因此，調控小膠質細胞的功能對于神經退行性疾病的治療具有重要意義。

近年來，中藥及其活性成分在PD治療方面顯示出一定的效果。Pae是從毛茛科植物牡丹皮、蘿藦科植物徐長卿中提取出來的一種中藥單體，目前有研究表明Pae具有一定的神經保護作用；（1）減輕腦缺血再灌注損傷，改善血腦屏障通透性，抑制活性氧生成，發揮抗炎作用[15]；（2）減輕阿爾茨海默病動物模型腦內的炎性損傷，有效改善阿爾茨海默病、血管性癡呆動物的認知功能障礙；（3）緩解動物模型的焦慮抑郁[16-18]；（4）抑制內毒素介導小膠質細胞炎癥[19]；（5）對PD神經元具有一定的神經保護作用，可減輕魚藤酮、MPP+誘導的神經元損傷，對MPTP誘導的PD小鼠也有一定的保護作用[4-5]，但目前尚無Pae對小膠質細胞激活作用的文獻報道。

由于小膠質細胞介導的神經炎癥是PD發病的重要機制，因此本研究以BV2小膠質細胞為研究對象，研究Pae對MPP+誘導的小膠質細胞激活的影響，以探尋一種有效的干預和藥物作用的新靶點。本研究結果顯示MPP+可誘導BV2小膠質細胞激活，促進細胞增殖、吞噬活性增強以及炎癥因子釋放；經MPP++Pae（5、25μmol/L）預處理后，可抑制以上效應，推測該作用可能與抑制小膠質細胞吞噬活性及抗炎作用有關。

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Paeonol pretreatment inhibits MPP+induced BV2 microglia activation in Parkinson disease

WANG Hao,ZHANG Zhenzhong,LI

Zhongchun,et al.Department of Neurology,Tongde Hospital of Zhejiang Pronince,Hangzhou 310012,China

Objective To investigate the effects of paeonol on MPP+induced BV2 m icrog lia activation,which is a cell model of Parkinson d isease. Methods After MPP+and paeonol p retreatment,cell viability was detected by CCK-8 assay; m icrog lial phagocytosis was assessed by immunostaining methods,and inflammatory cytokine release was determ ined according to the ELISA kits. Results MPP+treatment(0.1μmol/L)significantly enhanced BV2 m icrog lial cell viability,increased m icrog lial phagocytosis,and enhanced inflammatory cytokine of TNF-α,IL-1β,IL-6 release.Com pared to the MPP+g roup, Paeonol treatment(5,25μmol/L)significantly inhibited the increase of cell viability,dec reased m icrog lial phagocytosis,and reduced TNF-α,IL-1β,IL-6 release. Conclusion Paeonol can p revent MPP+induced BV2 m ic rog lia activation,and the mechanism may be related to inhibitm ic rog lialphagocytosis,and the anti-inflammatory effects.

Paeonol Parkinson d isease Microg lia Inflammatory cytokine

2016-11-04）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-1815

國家自然科學基金項目（81401566）；浙江省自然科學基金（LQ 15H 090005）；浙江省醫藥衛生科技項目（2015KYB076）；浙江省中醫藥管理局科研基金項目（2015ZB012）

310012杭州，浙江省立同德醫院神經內科（王浩、張震中、李中春）；浙江大學醫學院附屬第一醫院麻醉科（趙冰）

趙冰，E-mail：zhaobingzju@163.com