扁平苔蘚皮損中microRNA-155的表達及與Th17/Treg失衡的相關性

賀 琪 朱 旋 皮先明 石 全 李家文 胡 楓

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·論著·

扁平苔蘚皮損中microRNA-155的表達及與Th17/Treg失衡的相關性

賀 琪1，3朱 旋2，3皮先明1，3石 全1，3李家文4胡 楓5

目的： 檢測microRNA-155(miR-155)在皮膚扁平苔蘚(CLP)中的表達，明確其與輔助性T細胞17 /調節性T細胞(Th17/Treg)失衡的相關性。方法： 應用TaqMan探針法檢測33例CLP患者和25名健康對照者外周血中miR-155，孤兒受體-γt(RORγt)，白細胞介素-17A(IL-17A)，叉狀頭/翼狀螺旋轉錄因子P3(Foxp3)和IL-10的基因表達水平。結果： CLP中miR-155，RORγt、Foxp3和IL-17A 的表達較對照組顯著升高，而IL-10的表達顯著降低(均P<0.05)；CLP組中，miR-155分別與RORγt、Foxp3和IL-17A的含量顯著正相關(均P<0.001)，與IL-10的含量無明顯相關性(P>0.05)。結論： CLP中的miR-155過表達可能與Th17/Treg失衡有關。

microRNA-155； 扁平苔蘚； 輔助性T細胞17； 調節性T細胞； 白細胞介素-17A

micro-RNA(miRNA)在自身免疫病中的作用正逐漸被發現并重視。有學者發現口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)患者體內存在microRNA-155(miR-155)表達上調[1,2]和輔助性T細胞17 /調節性T細胞(T-helper 17 cell/regulatory T cell，Th17/Treg)免疫失衡[3]。研究證實miR-155是新型促炎CD4+T細胞亞類Th17細胞和對效應T細胞具有抑制作用的Treg細胞分化增殖的關鍵調控成分[4]，故本研究應用TaqMan探針法等方法檢測miR-155，Th17細胞的標志因子孤兒受體-γt(retinoid-acid receptor-related orphan receptor gamma，RORγt)和主要效應因子白細胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)，以及Treg細胞的標志因子叉狀頭/翼狀螺旋轉錄因子P3(forkhead box P3，Foxp3)和主要效應因子IL-10在皮膚扁平苔蘚(cutaneous lichen planus，CLP)患者外周血中的表達與關聯，以探討miR-155在CLP中的表達及其與Th17/Treg失衡的關系。

1 資料和方法

1.1 研究對象 CLP組外周血標本取材自2014年1月至2016年10月于我院皮膚科就診的門診患者，均經臨床和病理確診為CLP，共33例(男18例，女15例，年齡15～65歲，平均38.66±9.36歲)；所有患者均未患其他皮膚病，一個月內未接受系統治療，兩周內未接受局部治療。對照組外周血標本取材自同期我院健康體檢者，共25名(男16名，女9名，年齡19～58歲，平均25.12±10.22歲)，既往體健。本研究已獲湖北省中醫院倫理委員會批準，并獲得所有參與者的知情同意。

1.2 合成引物和探針 依照NCBI數據庫的基因序列來設計miR-155和內參U6核內小RNA(small nuclear RNA，snRNA)的引物和探針。miR-155 上游引物5’-GCCGTTAATGCTAATCGTGAT-3’，下游引物5’-TGGGTTCATTTCTGGGTCTT-3’，探針序列FAM-TCTATTCCATTGGTCTACT-MGB，U6 snRNA上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，探針序列FAM-AACGATACAGAGAAGATT-MGB，探針均以各自的下游引物作為逆轉錄特異性引物，以上由上海捷瑞公司合成。RORγt，Foxp3，IL-17A，IL-10和內參β-actin的引物信息見表1。

表1 人類基因引物列表

1.3 實驗方法

1.3.1 TaqMan探針法 應用TaqMan探針實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)法檢測miR-155和內參U6 snRNA。用密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，按參照總RNA提取試劑盒(寶曼，上海)說明書提取總RNA，應用紫外光分光光度法調整濃度到50 ng/μL。應用TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit(ABI，USA)合成cDNA，反應條件設置為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。應用TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI，USA)行Real-time PCR操作，陰性對照用去離子水代替cDNA，反應條件設置為95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環，每個標本檢測3次。

1.3.2 SYBR Green I染料法 應用SYBR Green I染料qRT-PCR法檢測RORγt，Foxp3，IL-17A，IL-10和內參β-actin。提取總RNA的步驟如上文，濃度調整至1 g/L。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，USA)行cDNA合成，采用FastStart Universal SYBR Green MasterRox(Roche，Germany)行Real-time PCR操作，陰性對照用去離子水代替cDNA，反應條件為95℃ 10 min，94℃ 15 s，59℃ 1 min，72℃ 1 min，40個循環，72℃最后延伸5 min。每個標本檢測三次。所有PCR檢測結果使用ABI 7500實時熒光定量PCR系統(ABI，USA)行定量分析，用內參進行數據標準化。

2 結果

2.1 miR-155、RORγt、Foxp3、IL-17A和IL-10的表達情況 與對照組相比，miR-155、RORγt、Foxp3和IL-17A在CLP組中的表達水平顯著上調，而IL-10的表達顯著降低(圖1)。

2.2 miR-155，RORγt，Foxp3，IL-17A和IL-10之間的關聯 通過對實驗結果的統計學分析發現，CLP組中miR-155的表達水平分別與RORγt、Foxp3和IL-17A的含量顯著正相關，RORγt與IL-17A的表達呈顯著正相關(圖2)；而IL-10與miR-155、RORγt、Foxp3和IL-17A的表達均無明顯相關性(r=-0.106，r=-0.095，r=0.223，r=-0.017，均P>0.05)。

圖1 a:TaqMan探針法檢測miR-155在對照組和CLP組中的基因表達水平；b:SYBR Green I染料法檢測RORγt、Foxp3、IL-17A和IL-10在對照組和CLP組中的基因表達水平

圖2 a：CLP組中，miR-155與RORγt的基因表達水平之間的相關性；b:CLP組中，miR-155與Foxp3的基因表達水平之間的相關性；c:CLP組中，miR-155與IL-17A基因表達水平之間的相關性；d:CLP組中，RORγt與IL-17A基因表達水平之間的相關性

3 討論

CLP是一種丘疹鱗屑性發疹性皮膚病，其發病涉及感染、免疫、精神等諸多因素。miRNA是一類包含18-25個核苷酸的非編碼小分子RNA，在哺乳動物中含量豐富，能在轉錄后水平上對mRNA進行關鍵性負調控[5]。有學者報道miR-155在OLP患者外周血和皮損中表達升高[1,2]，本研究發現miR-155在CLP患者外周血中的表達亦顯著上調，提示miR-155的異常表達與CLP的發病有關，然而其具體功能和機制尚不清楚。

本次研究的結果顯示RORγt，Foxp3和IL-17A在CLP患者外周血中表達均顯著上調，而IL-10的含量明顯下調，這幾種因子在CLP中的表達情況與此一致[3,6,7]，提示Th17細胞和Treg細胞皆參與了LP的發病，在患者體內異常增殖，且疾病進程中存在Th17細胞功能亢進和Treg細胞功能受損。本研究的統計學分析發現，CLP患者外周血中miR-155的含量與RORγt，Foxp3和IL-17A的含量均呈顯著正相關，而IL-10的含量與miR-155、RORγt、Foxp3和IL-17A的表達水平皆沒有明顯相關性，提示CLP中的miR-155過表達與Th17細胞和Treg細胞的異常增殖及Th17功能亢進有關，而Treg細胞功能受損與miR-155和Th17細胞的數量和功能變化無直接關聯。

文獻報道小鼠脾臟CD4+T細胞高表達miR-155可致RORγt和Foxp3表達上調，IL-17含量升高，而對CD4+T細胞抑制miR-155的表達則出現與上述相反的實驗結果，另一方面Treg細胞的主要效應因子IL-10和TGF-β1的含量不受miR-155表達變化的影響[4]，本研究的統計結果與以上基本一致。有學者發現Treg等免疫細胞分泌的IL-10能夠阻止Th17細胞分泌IL-17，進而抑制Th17介導的免疫炎癥[8]。因此可以推測，CLP中高表達的miR-155促使Th17細胞和Treg細胞分化增殖以及IL-17分泌增加，但對IL-10的分泌沒有明顯影響，同時CLP中IL-10表達顯著下調，故無法有效抑制Th17細胞介導的炎癥，致使Th17/Treg失衡出現或加重，疾病發生或發展。

綜上所述，CLP中存在外周血miR-155過表達，與Th17細胞和Treg細胞分化增殖以及Th17功能亢進有關，與Treg功能無關，可能涉及Th17/Treg失衡的調控。本研究首次探討CLP中miR-155的表達與Th17/Treg失衡的關系，為CLP的發病機理和miR-155的功能機制提供了新的理論和實驗依據，為CLP的靶向治療提供了新思路。但仍存在許多問題，例如CLP中miR-155的具體作用和機理，與Th17/Treg失衡的具體關聯和機制，IL-10異常表達的機制及其對Th17/Treg失衡和免疫炎癥的具體影響等，均有待進一步研究探討。

[1] 梁雪藝, 胡靖宇, 周剛. miR-155、miR-146a 在口腔扁平苔蘚患者外周血和組織中的變化與相關性研究[J]. 上海口腔醫學,2015,24(6):729-734.

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(收稿：2017-01-05 修回：2017-02-15)

Expression of microRNA-155 and the relationship with imbalance of Th17/Treg in the patients with lichen planus

HEQi1，3,ZHUXuan2，3,PIXianming1，3,SHIQuan1，3,LIJiawen4,HUFeng5.

1.DepartmentofDermatology,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430061,China; 2.DepartmentofUrology,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430061,China; 3.HubeiProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430074,China; 4.DepartmentofDermatology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China; 5.DepartmentofDermatology,WuhanFirstHospital,Wuhan430030,China

HEQi,E-mail:catty0004@163.com

Objective: To detect the expression level of microRNA-155 (miR-155) and to determine the relationship with the imbalance of T-helper 17 cell/regulatory T cell (Th17/Treg) in the patients with cutaneous lichen planus (CLP). Methods: The expression of miR-155, retinoid-acid receptor-related orphan receptor gamma (RORγt), interleukin-17A (IL-17A), forkhead box P3 (Foxp3) and IL-10 in peripheral blood of 33 patients with CLP and 25 normal controls were detected by TaqMan probe. Results: Compared with the normal controls, the expression levels of miR-155, RORγt, Foxp3 and IL-17A were higher and the level of IL-10 expression was lower in the CLP patients with CLP (P<0.05). The level of miR-155 expression was positively correlated with the expression levels of of RORγt, Foxp3 and IL-17A in the patients with CLP (Ps<0.001). There was no correlation between the expression level of miR-155 and IL-10. Conclusion: The miR-155-upregulation existed in the CLP patients may be associated with the imbalance of Th17/Treg.

microRNA-155; lichen planus; T-helper 17 cell; regulatory T cell; interleukin-17A

武漢市科技局青年科技晨光計劃項目 (編號：2015071704011621) 國家自然科學基金項目(編號：81502735)

1湖北省中醫院皮膚科，武漢，430061 2湖北省中醫院泌尿外科，武漢，430061 3湖北省中醫藥研究院，武漢，430074 4華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院皮膚科，武漢，4300225武漢市第一醫院皮膚科，武漢，430030

賀琪,E-mail: catty0004@163.com