CD8+T細(xì)胞對(duì)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的殺傷機(jī)制

馬錦媛 楊鈺琪 李舒麗 郭偉楠 宋 璞 安亞文 高天文 李春英

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·論著·

CD8+T細(xì)胞對(duì)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的殺傷機(jī)制

馬錦媛 楊鈺琪 李舒麗 郭偉楠 宋 璞 安亞文 高天文 李春英

目的： 明確CD8+T細(xì)胞對(duì)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的殺傷機(jī)制。方法： 分選白癜風(fēng)患者及正常人外周血CD8+T細(xì)胞，分別與原代黑素細(xì)胞及永生化正常黑素細(xì)胞系PIG1及永生化白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V建立共孵育殺傷模型，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靶細(xì)胞被殺傷情況，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)殺傷環(huán)境中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素的分泌水平。結(jié)果： 白癜風(fēng)患者外周血CD8+T細(xì)胞殺傷原代黑素細(xì)胞及PIG3V能力，分泌IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素水平均高于健康對(duì)照，而殺傷PIG1能力和TNF-α水平并無顯著差異；白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞IFN-γ分泌水平與細(xì)胞殺傷率呈明顯正相關(guān)。結(jié)論： 白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷黑素細(xì)胞是白癜風(fēng)發(fā)病的重要機(jī)制，且該殺傷作用可能依賴IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素分泌水平的上調(diào)。

白癜風(fēng)； CD8+T細(xì)胞； 干擾素γ； 顆粒酶B； 穿孔素

白癜風(fēng)是一種常見的由黑素細(xì)胞選擇性破壞導(dǎo)致的體表黑素減退性疾病，全球發(fā)病率近1%。目前白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制不清，有許多病因?qū)W理論，包括黑素細(xì)胞自身破壞學(xué)說、生化學(xué)說、神經(jīng)起源學(xué)說、自身免疫學(xué)說、遺傳學(xué)說等[1,2]。CD8+T細(xì)胞殺傷作用被認(rèn)為是白癜風(fēng)發(fā)病的重要機(jī)制之一，但具體機(jī)制仍不清。本文通過測(cè)定白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞及永生化黑素細(xì)胞系殺傷作用及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量，進(jìn)一步探討CD8+T細(xì)胞誘發(fā)白癜風(fēng)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞(細(xì)胞系)及組織來源 原代黑素細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科提供，取自8～22歲健康青年男性包皮術(shù)后組織(共8例)；PIGI細(xì)胞系(人表皮永生化黑素細(xì)胞系)及PIG3V細(xì)胞系(白癜風(fēng)表皮永生化黑素細(xì)胞系)由美國芝加哥大學(xué)Le Poole教授惠贈(zèng)；白癜風(fēng)患者血液樣本取自西京皮膚醫(yī)院進(jìn)展期白癜風(fēng)患者外周血(共8例)，對(duì)照組血液樣本取自西京皮膚醫(yī)院健康志愿者外周血(共8名)。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及主要儀器 254培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，人黑素細(xì)胞生長添加劑購于美國Cascade Biologics公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購于美國Sigma公司，H2O2原液購于日本TAKARA公司，鼠抗人CD8單克隆抗體購于美國Abcam公司，PerCP-Cy5.5-抗人CD8流式抗體購于美國eBioscience公司，碘化丙啶染色液(PI)購于碧云天生物技術(shù)有限公司，人IFN-γ、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購于美國RD公司，人顆粒酶B ELISA及穿孔素ELISA檢測(cè)試劑盒購于美國RD公司。流式細(xì)胞分選及分析儀購于美國BD公司，酶標(biāo)儀購自于美國BIO-RAD公司。

1.3 殺傷環(huán)境的建立及殺傷細(xì)胞比率檢測(cè) 使用254無血清培養(yǎng)基配制0.75 mmol/L H2O2處理靶細(xì)胞(原代黑素細(xì)胞及PIG1、PIG3V細(xì)胞系)誘導(dǎo)發(fā)生抗原暴露，分別于離心管內(nèi)種植靶細(xì)胞1×105個(gè)細(xì)胞/管，并分別向各組管內(nèi)加入2×105個(gè)細(xì)胞/管對(duì)照組或白癜風(fēng)患者通過磁珠分選出的CD8+T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞與原代黑素細(xì)胞、PIG1細(xì)胞及PIG3V細(xì)胞HLA分型適配)，按2∶1的細(xì)胞數(shù)比例建立CD8+T細(xì)胞與黑素細(xì)胞(原代黑素細(xì)胞、PIG1細(xì)胞及PIG3V細(xì)胞)的殺傷體系；將各組離心管進(jìn)行800 rpm×5 min離心，使效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞緊密結(jié)合，37℃過夜孵育16 h，棄上清液，加入200 μL/管PBS重懸細(xì)胞，隨后加入PI并調(diào)整濃度至1 μg/mL，混勻震蕩，室溫避光染色15 min；1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.4 ELISA檢測(cè)殺傷體系中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素含量 按照1.3步驟建立CD8+T細(xì)胞與PIG1、PIG3V細(xì)胞殺傷體系；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒來源見1.2，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)軟件及統(tǒng)計(jì)圖制作 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了三次獨(dú)立重復(fù)后統(tǒng)計(jì)分析，采用Graphpad Prism 5.0軟件，各組間均數(shù)比較采用雙向方差分析及studentt檢驗(yàn)，用直線相關(guān)分析法處理指標(biāo)間的關(guān)系，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8+T細(xì)胞殺傷黑素細(xì)胞比例 白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞對(duì)原代黑素細(xì)胞殺傷率均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1a，P=0.003)。白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷對(duì)PIG3V細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯升高(P=0.0411)，而在PIG1細(xì)胞中兩者無明顯差異(圖1b，P=0.1467)；在對(duì)照組和白癜風(fēng)患者組中，CD8+T細(xì)胞對(duì)PIG3V細(xì)胞的殺傷作用明顯高于對(duì)PIG1的殺傷作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1b，P=0.025)。

圖1 a.白癜風(fēng)患者及正常人群CD8+T細(xì)胞致原代黑素細(xì)胞死亡比例(n=8，**P<0.01)；b.白癜風(fēng)患者及正常人群CD8+T細(xì)胞致PIG1、PIG3V細(xì)胞死亡比例(n=8，*P<0.05)

2.2 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)殺傷體系中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素的分泌水平 白癜風(fēng)患者組CD8+T細(xì)胞殺傷PIG1及PIG3V細(xì)胞時(shí)IFN-γ分泌水平較對(duì)照組明顯升高(圖2a，PIG1組P=0.0119、PIG3V組P=0.0101)，而TNF-α分泌水平并無明顯變化(PIG1組P=0.3089、PIG3V組P=0.4498)。白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷PIG1及PIG3V細(xì)胞時(shí)顆粒酶B的分泌水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.001)，但在PIG1及PIG3V細(xì)胞間無明顯差異(圖2b)。白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷PIG1及PIG3V細(xì)胞時(shí)穿孔素分泌水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.001)，且針對(duì)PIG3V細(xì)胞分泌的穿孔素水平明顯高于針對(duì)PIG1細(xì)胞的分泌水平(圖2c，P=0.0015)。

圖2 白癜風(fēng)患者及正常人群CD8+T細(xì)胞與PIG1、PIG3V共孵育環(huán)境中IFN-γ (a，n=5，*P<0.05)、顆粒酶B(b，n=7，***P<0.001)及穿孔素(c，n=6，**P<0.01，***P<0.001)表達(dá)水平

3 討論

CD8+T細(xì)胞在多種自身免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮作用。有報(bào)道斑禿患者及銀屑病患者外周血中CD8+T細(xì)胞數(shù)量上升[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)殺傷黑素細(xì)胞是白癜風(fēng)重要的發(fā)病機(jī)制之一。有研究認(rèn)為白癜風(fēng)患者血液及皮損中均可出現(xiàn)抗黑素細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞，且數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。同時(shí)，白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞能夠殺傷無皮損部位的黑素細(xì)胞[4]，提示CD8+T細(xì)胞的殺傷作用與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。Zhang等[5]報(bào)道非節(jié)段型白癜風(fēng)患者活躍期表達(dá)皮膚歸巢CD8+T細(xì)胞中趨化因子受體CCR4表達(dá)水平明顯升高。Byrne等[6]研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)受累的小鼠CD8+T細(xì)胞可針對(duì)黑素細(xì)胞分化抗原TRP2反應(yīng)。本研究通過流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在原代黑素細(xì)胞及永生化細(xì)胞系中，白癜風(fēng)患者的CD8+T細(xì)胞均可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞殺傷增加，也進(jìn)一步證明了上述觀點(diǎn)。

CD8+T細(xì)胞誘發(fā)白癜風(fēng)的分子機(jī)制方面，有研究認(rèn)為T細(xì)胞能夠通過胞內(nèi)聯(lián)接引導(dǎo)Fas配體(FasL)與靶細(xì)胞上凋亡相關(guān)的Fas分子結(jié)合，從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[7]。然而也有文獻(xiàn)報(bào)道在白癜風(fēng)患者中CD8+T細(xì)胞FasL含量并無明顯上升，提示FasL可能在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞死亡中沒有重要意義[8]。Lili等[9]通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定白癜風(fēng)患者CD3+T細(xì)胞中IFN-γ+CD8+T細(xì)胞、顆粒酶B+CD8+T細(xì)胞(GrB+CD8+T細(xì)胞)及穿孔素+CD8+T細(xì)胞(Perforin+CD8+T細(xì)胞)比例較正常人明顯升高。本研究建立的殺傷環(huán)境中，白癜風(fēng)患者組上清液的IFN-γ，顆粒酶B及穿孔素水平均有不同程度升高，也從另一角度證實(shí)白癜風(fēng)患者表達(dá)IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素的CD8+T細(xì)胞比例升高。同時(shí)，在白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞參與的殺傷環(huán)境中，PIG3V細(xì)胞組上清中的穿孔素含量較PIG1細(xì)胞也明顯升高，說明白癜風(fēng)患者的黑素細(xì)胞可能存在某種機(jī)制誘導(dǎo)Perforin+CD8+T細(xì)胞增殖或促進(jìn)CD8+T細(xì)胞表達(dá)分泌穿孔素。Zhang等[5]通過實(shí)驗(yàn)也認(rèn)為白癜風(fēng)患者表皮內(nèi)可能存在某種抗原誘使CD8+T細(xì)胞增殖及歸巢，且這一現(xiàn)象中存在CCR4的參與,但具體發(fā)生機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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(收稿：2016-09-07 修回：2016-10-26)

Mechanism of CD8+T cells killing melanocytes in the patients with vitiligo

MAJinyuan,YANGYuqi,LIShuli,GUOWeinan,SONGPu,ANYawen,GAOTianwen,LIChunying.

DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi'an710032,China

LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the killing mechanism of CD8+T cells to melanocytes in the patients with vitiligo. Methods: CD8+T cells were obtained from peripheral blood in 8 patients with vitiligo and 8 healthy controls. The primary melanocyte, immortalized normal melanocyte cell line PIG1 and immortalized vitiligo melanocyte cell line PIG3V were co-cultivated with selected CD8+T cells respectively. The number of the death of melanocytes killed by CD8+T cells was assessed by Flow cytometry. The expression levels of IFN-γ, TNF-α, granzyme B and perforin were measured by ELISA. Results: The number of died primary melanocytes and PIG3V killed by CD8+T cells, the expression level of IFN-γ, granzyme B and perforin in the patients with vitiligo was higher than those in controls. There was no significant difference in the number of died PIG1 and the expression level of TNF-α between the patients and healthy controls. There was an obviously positive correlation between the level of IFN-γ secreted by CD8+T cells and the number of died melanocytes killed by CD8+T cells. Conclusion: The killing of melanocytes by CD8+T cells plays an important role in the development of vitiligo, which probably depends on the increased expression of IFN-γ, granzyme B and perforin.

vitiligo; CD8+T cells; IFN-γ; granzyme B; perforin

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81502717, 81602764, XJZT15M10)

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，陜西西安，710032

李春英，E-mail: lichying@fmmu.edu.cn