基于CRISPRCas/9基因編輯技術在HSV—1病毒感染疾病治療中的應用sgRNA序列的設計

李昭君

【中圖分類號】R373 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）05-0-01

1.前言

在當今時代，對基因突變進行治療，必須依靠基因編輯技術。CRISPR/Cas9基因編輯技術是繼ZFN和TALEN技術之后迅速發展起來的第3代基因組編輯技術。該系統的核心由Cas9蛋白以及單鏈引導RNA（sgRNA）組成。CRISPR/Cas系統要發揮功能必須滿足兩個條件：一個是SgRNA與靶點DNA序列按照堿基互補原則配對；另一個是在與SgRNA配對的靶序列3'端必須緊跟PAM序列。CRISPR/Cas系統靶向新的靶點只需要合成新的SgRNA，操作簡便，效率高，在基因編輯領域中被廣泛應用。

2.實驗目的

單純孢疹病毒（HSV）的感染十分普遍，分為HSV-1和HSV-2，其中HSV-1是一種嗜神經病毒，主要引起生殖器以外的皮膚，粘膜和器官包括腦的感染。而HSV-1是一種DNA病毒，因此可以利用CRISPR Cas9嘗試解決，從病毒的復制出發，剪切病毒DNA復制過程中的重要位點，可以達到抑制病毒復制的目的，這也為后來利用CRISPRCas9治療其他更復雜危害性更大的病毒性疾病提供參考。

3.實驗原理

3.1 CRISPRCAS/9原理

CRISPR/Cas9依賴于crRNA或sgRNA上的20個堿基的向導序列與目的DNA，以及PAM（NGG）序列決定切割位點的特異性。sgRNA的設計和選擇是Crispr-Cas9技術的精髓，也是實驗是否成功的關鍵一步。sgRNA決定了Cas9的靶向性和特異性[3]。對于目前廣泛應用的土壤農桿菌系統來說：sgRNA序列的3‘端必須是NGG序列（例如：5′GTCACCTCCAATGACTAGGGNGG-3′），Cas9會在PAM序列5‘端大約3bp處對DNA序列進行切割。

3.2 sgRNA設計

3.2.1 設計原則

（1）對于sgRNA的長度，一般應為20nt左右；

（2）對于sgRNA序列的堿基組成，可選3'末端含GG的sgRNA，同時sgRNA種子序列盡量避免以4個以上的T結尾，GC%含量最佳為40%～60%；

（3）sgRNA的種子序列與脫靶位點的匹配數盡可能低。

另外SgRNA的活性與CRISPR系統的突變效率直接相關，所以在著手進行基因編輯前，設計并找到有活性的靶點至關重要，通常在設計特異性靶點后，需要進行體外細胞活性篩選，篩選出有效的靶點用于后續實驗。

3.2.2 靶序列的選擇

根據提供的物種、基因名稱或者基因ID在NCBI中進行查找，找到該基因CDS區[4]，分析相應的基因組結構，明確CDS的外顯子部分。按照基因本身的性質，選擇候選的待敲除位點，確定待敲除位點。對于蛋白編碼基因，如果該蛋白具重要結構功能域，可考慮將基因敲除位點設計在編碼該結構域的外顯子；如果不能確定基因產物性質，可選擇將待敲除位點放在起始密碼子ATG后的外顯子上。確定待敲除位點后，選擇23-至250bp的外顯子序列輸入到在線免費設計sgRNA的軟件Input框中，然后進行設計運算，軟件會自動輸出sgRNA序列。

4.實驗步驟

4.1 CDS區域的選擇

HSV-1基因組為152kb的線性雙鏈DNA，在宿主細胞核內以級聯反應的方式表達病毒蛋白。根據基因表達時序的不同，HSV-1基因可分為立即早期基因（IE）、早期基因（E）、和晚期基因。立即早期基因轉錄出現在病毒的DNA復制之前，立即早期基因轉錄后，激活隨后的早期基因和晚期基因，引起病毒的復制及感染。

其中，ICP27蛋白就屬于立即早期基因編碼的蛋白之一[5]，在HSV-1生命周期的IE期產生，主要調節病毒和宿主細胞mRNA的合成與成熟，敲除ICP27可阻斷HSV-1病毒的復制，是HSV-1復制必需的高保守蛋白，而且與其他孢疹病毒的基因產物存在較高的同源性。因此我們決定將Crispr的靶序列定位在編碼ICP27蛋白的編碼區（CDS區域）。

我們通過NCBI網站查找ICP27的編碼區

（1）首先通過查找HSV-1之后查找ICP27蛋白

（2）在出現的搜索結果中選擇HSV-1的ICP27蛋白，然后查看該結果

（3）在出現的HSV-1的ICP27蛋白的信息中選擇CDS，單擊，然后點擊右下角的FASTA，最終得到ICP27蛋白的CDS區的堿基序列，根據ICP27蛋白的CDS區的堿基序列設計sgRNA。

4.2 目標序列選取

運行http：//crispr.mit.edu/網址，將編碼ICP27蛋白的CDS序列分段輸入到在線免費設計sgRNA的軟件Input框中，然后進行設計運算，軟件會按照分數由高到低自動輸出目標序列，從中選取分數最高，脫靶最少的目標序列進行設計。通過比較分析，選出了一條得分最高99分，脫靶最少為4的最佳目標序列，即GATACTCGACGCCGCTCGCCCGG

4.3 合成sgRNA序列，構建表達載體

4.3.1 表達載體的構建

我們的標記基因將選用EGFP（增強綠色熒光蛋白），選擇基因選用Puro（嘌呤霉素），以此來構建載體，將合成的sgRNA序列導入到質粒中，進而導入到細胞中，進行驗證。

5.結語

CRISPR-Cas9設計簡單、應用靈活、操作簡便，在敲除細胞表面受體和切割病毒基因組、抑制病毒復制中有顯著效果。因此下一步我們將驗證我們所設計的SgRNA是否有效。可以說，在未來臨床應用以及基因治療中還有很長的一段路要走，比如提高Cas9編輯的準確性，避免脫靶現象出現等等。研究人員需要不斷優化系統，降低脫靶效應，提高Cas9基因轉導效率等。CRISPR-Cas9作為新的基因編輯技術，在慢性病毒感染或潛伏病毒感染疾病中具有巨大的潛在科學研究和臨床治療意義。