苦豆子遺傳轉化體系建立及SaLDC啟動子缺失分析

陸姍姍+孟祥善+李娟+楊毅+劉萍+劉妍

[摘要] 藥用植物遺傳轉化體系的建立對其功能基因研究具有重要意義，該研究在已有苦豆子再生體系的基礎上，對農桿菌菌液濃度、農桿菌侵染時間、農桿菌與苦豆子愈傷組織的共培養時間、愈傷組織預培養時間、乙酰丁香酮添加方式和乙酰丁香酮濃度6個遺傳轉化因子進行優化，結果表明在預培養15 d的苦豆子愈傷組織中農桿菌菌液濃度A600為0.9、侵染時間15 min、農桿菌與愈傷組織共培養48 h、并在侵染液中添加AS 200 μmol·L^-1時，GUS瞬時轉化效率高達83.33%。以苦豆子基因組DNA為模板克隆獲得SaLDC上游1 260 bp的啟動子序列（GenBank登錄號KY038928），將不同長度（310，594，765，924，1 260 bp）的啟動子缺失片段分別與GUS報告基因融合，構建的植物表達載體經農桿菌介導轉化苦豆子愈傷組織，GUS瞬時表達結果顯示，5個不同長度的SaLDC啟動子片段均可驅動GUS在苦豆子愈傷組織中的表達，表明克隆所得的SaLDC啟動子具有啟動活性，以310 bp的片段啟動活性最強，為進一步分析該啟動子功能奠定了基礎。

[關鍵詞] 苦豆子； 賴氨酸脫羧酶（LDC）； 啟動子基因； GUS瞬時表達； 功能分析

[Abstract] Establishing the genetic transformation system of medicinal plant is important to study their functional genes. Based on the established regeneration system of Sophra alopecuroides， 6 factors of genetic transformation were optimized， that was the concentration of Agrobacterium tumefaciens， the infection time， the co-cultivation time of agrobacterium tumefaciensand S.alopecuroides callus， the preculture time of S.alopecuroides callus， the adding method ofacetosyringone （AS） and the concentration of AS， respectively. The results showed that a maximum genetic transformation efficiency of 83.33% was achieved with 15d-precultured of S.alopecuroides callus， which was infected by A600=0.9 A. tumefaciens for 15 minutes and then co-cultivated for 48 hours with 200 μmol·L^-1AS. The promoter sequence （1 260 bp） of upstream SaLDC was cloned from S.alopecuroides genomic DNA （gene bank accession number： KY038928）. The deletion fragment of SaLDC promoter with different length （310，594，765，924，1 260 bp） were ligated with the GUS reporter gene to form five plant expression vectors named P310，P594，P765，P924，P1260， which were then transferred into S.alopecuroides callus. The GUS transient expression showed that all 5 different deletion fragment of SaLDC promoter can drive the GUS gene expression in S. alopecuroides callus. The SaLDC promoter we cloned has high promoter activity， and they may facilitate its function analysis in the future.

[Key words] Sophra alopecuroides； lysine decarboxylase （LDC）； promoter gene； GUS transient expression； function analysis

苦豆子Sophra alopecuroides L.別名苦豆根、苦甘草和歐苦參等，是豆科槐屬多年生草本植物，廣泛分布于寧夏、新疆、內蒙古、甘肅、西藏等荒漠、半荒漠和草原邊緣地帶[1]。苦豆子地下根部粗壯且多側根，加之其較強的耐旱性、耐鹽堿和抗風沙等性能，在西北地區的生態環境中有著重要的保護作用[2]。苦豆子也是我國西北地區重要的藥用植物，具有抗腫瘤、抗菌消炎、止痛殺蟲、通經活血等功效[3-4]，其中氧化苦參堿（oxymatrine，OMA）（又稱苦參素）在治療慢性乙型病毒性肝炎、苦參堿（matrine，MA）在治療婦科炎癥中均有很好的療效[5]，此外，苦參堿生物農藥由于具有對人畜毒性低等特點，在我國也有廣泛的應用[6]。

OMA和MA屬于喹諾里西啶類生物堿（quinolizidine Alkaloids，QAs）[7]，QAs是賴氨酸在賴氨酸脫羧酶作用下脫羧產生的戊二胺（尸胺）經過一系列的生化代謝而成[8]。賴氨酸脫羧酶（lysine decarboxylase，LDC）作為QAs生物合成途徑的第一個關鍵酶[9]，在OMA和MA生物合成過程中有著至關重要的作用。楊毅等[10]克隆獲得了苦豆子SaLDC基因，并發現苦豆子SaLDC的表達和OMA的積累均受干旱脅迫的影響，且基因的表達量與OMA的積累呈正相關關系。逯明輝等[11]利用cDNA-AFLP技術從耐冷性強的黃瓜中獲得了132 bp長的LDC部分片段，推測該基因可能在提高種子低溫發芽力方面起重要作用。

在植物遺傳轉化過程中，GUS瞬時表達常被用于快速確定和優化各種影響轉化效率的因素，繼而建立高效遺傳轉化體系[12]。啟動子在基因轉錄起始和轉錄頻率的調控中有決定性作用，可以控制結構基因的表達起始時間和表達程度的強弱[13]，啟動子缺失分析是研究啟動子及其調控元件功能的一種重要且有效的方法[14]。邵克強等[15]通過5′端缺失系統研究了水稻Pib啟動子中分子元件YTCANTYY的拷貝數與啟動子啟動活性和暗誘導性的關系。Ren等[16]通過對水稻OsMT2b啟動子的缺失分析明確該啟動子從-21～-212是最短的活性區域。本研究在已有苦豆子再生體系的基礎上，研究影響其遺傳轉化效率的各種因素，構建SaLDC不同啟動子缺失片段與報告基因GUS的重組表達載體，探討不同啟動子缺失片段在苦豆子愈傷組織中的瞬時表達水平，以期對苦豆子SaLDC啟動子的功能進行系統研究，為啟動子的順式作用元件與相關轉錄因子的互作研究提供依據，也為今后詳細研究SaLDC在OMA生物合成途徑中的地位奠定基礎。

1 材料

苦豆子植株由寧夏大學農學院李曉偉副教授鑒定為S. alopecuroides，種子采于寧夏永寧縣楊和鄉（106.14°E，38.14°N），憑證標本號為103，室溫風干后脫粒并精選。

根癌農桿菌Agrobacterium tumefaciens EHA 105和pBI121質粒載體由本實驗室保存；Taq DNA聚合酶購自TaKaRa生物工程有限公司；克隆載體pGEM-T1simple、DNA膠回收試劑盒和GUS組織化學染色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide，X-Gluc）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；T4DNA連接酶和限制性內切酶HindⅢ，BamHⅠ均購自NEW ENGLAND生物工程有限公司；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他試劑均為進口或國產分析純。

2 方法

2.1 苦豆子子葉節愈傷組織的獲得

挑選潔凈、飽滿、大小一致的苦豆子種子去硬實，無菌處理后接種于MS基本培養基上使其發芽。6 d后選取生長健壯、未展開子葉的無菌苗切取子葉節（離上胚軸基部和下胚軸各約3 mm），沿子葉下胚軸垂直剖開，刮去已長出的腋芽，縱切面朝下接種于MS+0.5 mg·L^-12，4-D+0.5 mg·L^-1 6-BA的誘導培養基上，培養溫度（28±1）℃，16 h/8 h光/暗體系，光照1 200～1 600 lx。

2.2 農桿菌介導的苦豆子瞬時轉化體系建立

分別對苦豆子愈傷組織的預培養時間、農桿菌（含pBI121質粒）侵染時間、侵染濃度、愈傷組織與農桿菌的共培養時間、乙酰丁香酮（AS）添加方式及濃度6個因素進行研究。所有因子均按單一因素進行優化，以報告基因GUS瞬時表達率的高低反映各因子對轉化效率的影響（GUS瞬時表達率以50%以上有靛藍色反應的外植體數占被檢測外植體總數的百分數計），每處理20個外植體，3次重復，得到最佳農桿菌介導的苦豆子瞬時轉化體系。

2.3 不同長度的啟動子片段獲得及植物表達載體構建

利用Primer Premier 5.0軟件設計SaLDC啟動子5個不同長度片段的上游引物（P1，P2，P3，P4，P5）和1個共用下游引物（R）（表1），以苦豆子基因組DNA為模板擴增不同長度的啟動子序列。PCR反應體系（20.0 μL）：DNA模板2.0 μL，10×Buffer2.0 μL，dNTP（2.5 mmol·L^-1）3.2 μL，上下游引物（10.0 μmol·L^-1）各1 μL，Taq DNA polymerase （5.0 U·μL^-1）0.2 μL，dd H2O 10.4 μL；PCR反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃2 min；36個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

目標片段經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收純化后分別連接至pGEM-T1 simple載體，熱激轉化大腸桿菌TOP10，藍白斑、氨芐青霉素抗性平板篩選出陽性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

分別提取含苦豆子不同長度啟動子片段的質粒DNA，用HindⅢ，BamHⅠ進行雙酶切并回收目的片段，同時雙酶切pBI121質粒，用目的片段代替其中35S啟動子，T4 DNA連接酶連接后得到具有不同長度SaLDC啟動子片段的重組表達載體，依次命名為P310，P594，P765，P924，P1260（圖1）。表達載體導入大腸桿菌TOP10，利用pBI121中卡那霉素抗性基因nptⅡ進行重組質粒陽性克隆篩選，選取陽性菌株提取質粒并進行雙酶切驗證。

2.4 農桿菌介導表達載體瞬時轉化苦豆子愈傷組織

構建好的植物表達載體分別轉化至農桿菌EHA105，Kan篩選，陽性單克隆于含Kan（50 mg·L^-1）的LB液體培養基中28 ℃培養至A600 = 0.8～1.5，菌體用侵染液（1/2MS+5%蔗糖+200 μmol·L^-1 AS）懸浮至A600 =0.9，按試驗設計轉化已培養15 d的苦豆子愈傷15 min，無菌濾紙吸掉愈傷表面多余的菌液后接種于誘導培養基中，26 ℃黑暗共培養48 h經無菌水清洗、吸干水分，一部分用于GUS組織化學染色，另一部分用500 mg·L^-1頭孢霉素（Cef）水溶液清洗后，轉MS+0.1 mg·L^-1NAA+1.25 mg·L^-1 6-BA+500 mg·L^-1Cef分化培養基上繼續脫菌分化培養。每處理10塊外植體，重復3次，以非轉基因苦豆子愈傷為陰性對照（CK-），CaMV35S啟動子驅動GUS的pBI121轉化苦豆子愈傷作為陽性對照（CK+）。

2.5 苦豆子外植體GUS組織化學染色

經農桿菌侵染或未侵染的苦豆子外植體或愈傷用GUS組織化學染色液進行染色，37 ℃過夜，75%乙醇脫色，期間更換數次直至洗脫液無色為止，仔細觀察、統計染色情況并拍照。染色液組成：50 mmol·L^-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.0），50 mmol·L^-1鐵氰化鉀，50 mmol·L^-1亞鐵氰化鉀，0.1 mol·L^-1 Na2EDTA，1 g·L^-1X-Gluc。

2.6 統計分析

利用DPS 6.0對所有數據進行方差分析。

3 結果與分析

3.1 農桿菌介導的苦豆子瞬時轉化體系的建立和優化

3.1.1 農桿菌菌液濃度對瞬時轉化的影響 將預培養15 d的苦豆子愈傷，分別在菌液濃度A600為0.3，0.6，0.9，1.2的農桿菌菌液中侵染15 min，黑暗共培養48 h，結果表明菌液濃度對轉化效率具有顯著影響（P<0.05）。在A600為0.3～0.9時，菌液濃度越大瞬時轉化效率越高，菌液濃度A600=0.3，GUS瞬時表達率僅為23.33%，A600 =0.6～0.9時，瞬時表達率都在60.00%以上（表2），但當菌液濃度A600 =1.2時，愈傷組織經過48 h共培養后基本被農桿菌覆蓋，整體褐化嚴重、軟化并且喪失活性，轉化效率降低，GUS瞬時表達率只有30.00%（圖2A）。

3.1.2 農桿菌侵染時間對瞬時轉化的影響 用A600 =0.9的農桿菌菌液對預培養15 d的苦豆子愈傷組織分別侵染5，10，15，20 min，黑暗共培養48 h，結果顯示，在5～15 min隨著侵染時間的延長，GUS瞬時表達率極顯著增加（P<0.01），侵染15 min時，愈傷長勢良好，且表達率達66.67%，極顯著高于其他侵染時間（表2），侵染20 min共培養48 h后，發現有大量愈傷組織出現軟腐癥狀，后續培養變黑死亡（圖2B）。

3.1.3 共培養時間對瞬時轉化的影響 農桿菌與愈傷組織的共培養過程是外源基因導入受體細胞的關鍵時期，將預培養15 d的苦豆子愈傷經A600 =0.9的農桿菌侵染15 min，分別進行24，48，72 h的共培養后做除菌處理。共培養24 h，農桿菌生長量較低，愈傷表面肉眼不可見農桿菌菌落，對愈傷未造成大面積的侵染，GUS瞬時表達率僅為36.67%；共培養48 h，愈傷表面可見到農桿菌菌落，愈傷開始褐化，但此時遺傳轉化效率較高，GUS瞬時表達率達66.67%；共培養72 h，愈傷褐化嚴重。研究發現，共培養超過48 h后，由于農桿菌的過渡繁殖，阻斷了愈傷組織細胞對營養成分的吸收，從而抑制細胞的正常生長，使得愈傷褐變、枯萎，死亡率升高，導致瞬時表達率下降為18.33%（圖2C，表2）。

3.1.4 子葉節預培養時間對瞬時轉化的影響 根據本實驗室苦豆子愈傷組織誘導結果可知，苦豆子子葉節經2～3 d的培養后膨脹，4～10 d開始形成愈傷，但長勢緩慢，10～15 d愈傷因快速生長而膨大，20 d后愈傷停止生長，23 d后愈傷褐化。本研究將子葉節分別進行0，2，10，15，20，23 d的預培養，用A600 =0.9的含pBI121質粒的農桿菌EHA105侵染15 min，黑暗共培養48 h。研究表明，苦豆子子葉節的預培養時間顯著影響轉化效率，預培養0～2 d，子葉節才開始產生愈傷，農桿菌的侵染效率低；預培養10～15 d由于子葉節正處于愈傷增生期，愈傷組織細胞分裂速度快，結構疏松，細胞壁薄，有利于外源基因的導入，統計顯示，GUS瞬時表達率可達到60.00%以上（表2），與其他4個預培養時間有極顯著差異（P<0.01）；隨著預培養天數的增加子葉節愈傷褐化嚴重，轉化效率急劇下降（圖2D）。

3.1.5 AS對瞬時轉化的影響 農桿菌對植物酚類化合物具有趨化性，它可以使農桿菌Ti質粒上的Vir活化和表達[17]。本研究分別向共培養基和侵染液中添加濃度梯度為100，200，300 μmol·L^-1的AS，以不添加AS為對照。結果表明在共培養基內添加不同濃度AS對苦豆子愈傷轉化效率沒有影響（圖2E），各濃度梯度間無顯著性差異（表2）；但在侵染液中添加一定濃度的AS可以有效提高農桿菌對愈傷的轉化效率，其中AS濃度為200 μmol·L^-1時GUS瞬時表達率最高為83.33%，顯著高于其他各濃度的表達效率（表2），且染色覆蓋率都較高，單塊愈傷染色覆蓋率可達90%以上（圖2F），但當AS濃度為300 μmol·L^-1時，轉化效率極顯著下降（P<0.01）。

3.2 不同長度的SaLDC啟動子缺失片段分析

3.2.1 不同長度啟動子片段的獲得及植物表達載體構建 以苦豆子基因組DNA為模板，利用設計的5條上游引物和1條下游引物分別進行PCR擴增，獲得310，594，765，924，1 260 bp 5條長度不同的啟動子片段，依次定向替換pBI121載體上的CaMV35S啟動子，連接并轉化到大腸桿菌TOP10，菌液PCR檢測后雙酶切驗證，已成功獲得5個啟動子片段的植物表達載體（P310，P594，P765，P924，P1260，圖3）。

3.2.2 不同長度SaLDC啟動子片段在苦豆子愈傷中的瞬時表達 將構建好的5個植物表達載體（P310，P594，P765，P924，P1260）以及陽性對照質粒通過農桿菌介導分別轉化苦豆子愈傷組織。通過GUS組織化學染色發現，5個不同長度的SaLDC啟動子序列都能驅動GUS的表達，說明這5個啟動子序列均具有啟動必備的作用元件活性，能驅使下游基因表達，但觀察發現表達水平有明顯差異，以310，594 bp的啟動子片段GUS瞬時表達強度最高，隨著SaLDC啟動子片段長度的增加，GUS瞬時表達強度逐漸下降，924，1 260 bp的啟動子片段瞬時表達強度都明顯減弱，非轉化愈傷組織中無GUS表達（圖4），5個啟動子片段的GUS瞬時表達率分別為73.33%，66.67%，60.00%，43.33%，40.00%。P310，P594的GUS瞬時表達率均極顯著高于P924，P1260（P<0.01）。

4 討論

遺傳轉化是細菌與植物相互作用的過程，對外植體進行預培養，嚴格控制農桿菌侵染時間、農桿菌與愈傷組織的共培養時間，選擇合適的農桿菌濃度以及添加乙酰丁香酮等酚類物質均可有效提高遺傳轉化的效率[18-19]。宿主細胞的生理狀態和發育過程對遺傳轉化的結果有明顯影響，只有當其處在對農桿菌良好的感受態時，才能有效接受外源DNA，啟動遺傳轉化。培養15 d的苦豆子愈傷生長旺盛，處于增生期，GUS瞬時表達率最高，這與Collado[20]等研究菜豆處于增生期愈傷更有利于遺傳轉化的結果一致。農桿菌侵染時間和菌液濃度也是影響植物遺傳轉化效率的重要因素，本研究發現農桿菌菌液濃度A600控制在0.6～0.9，侵染時間為15 min可獲得高的瞬時表達率。農桿菌附著后并不能立刻轉化植物細胞，只有在創傷部位生存16 h以上的菌株才有此功能[21]，但是共培養時間過長，植物細胞易受毒害而死亡，并且導致后續操作中脫菌困難，本研究對苦豆子愈傷和農桿菌共培養48 h既可以得到最高的轉化效率，同時又不致使愈傷組織細胞過度受害。

農桿菌Ti質粒的Vir區基因對T-DNA轉移起介導作用，它靠植物受傷細胞產生的酚類化合物激活，AS誘導己知所有Vir調節子[22]。多數學者認為在共培養基內添加AS可有效提高GUS瞬時表達率[23-25]，但也有研究認為由于不同植物對AS反應的敏感程度不同，共培養基內添加AS對有些植物的遺傳轉化并不是必不可少的[26]。本研究就AS不同添加方式和添加濃度做了一系列探索，研究發現共培養基內添加AS，GUS瞬時表達率與對照無顯著性差異，但在侵染液中添加AS可有效提高瞬時表達率，這可能是在共培養基中添加AS，愈傷組織只能與共培養基接觸面的活化農桿菌相接觸，而在侵染液中添加AS，侵染過程中農桿菌全方位包裹并附著于愈傷組織，在共培養過程中更有利于表達載體導入愈傷組織，從而使得轉化效率顯著增加，相似的結論在他人的研究中也有報道[27]。然而添加AS的濃度并不是越高越好，在侵染液中添加300 μmol·L^-1的AS，愈傷褐化嚴重，GUS瞬時表達率降低至56.67%，與添加100～200 μmol·L^-1AS的瞬時表達率差異極顯著。一方面可能由于高濃度的酚類物質本身使外植體毒害致死，另一方面由于農桿菌介導的外源基因轉化是農桿菌菌株與植物細胞之間相互作用的結果，過高濃度的AS將過度誘導Vir的表達，增強了農桿菌侵染活力，使轉化的植物細胞受農桿菌毒害而死亡。

在已報道的植物啟動子中，大多數均富含A/T序列，這是基因啟動子的一個基本特征[28]，本研究SaLDC啟動子序列中A/T量高達90%，G/C量僅占10%，說明該啟動子轉錄時DNA解旋所需消耗的能量更小[29]，GUS瞬時表達顯示SaLDC啟動子具有較強的轉錄活性，說明高含量的A/T使得DNA雙鏈結構更易解螺旋從而提高基因的轉錄效率。

真核基因表達是非常復雜的調控過程，研究基因的啟動子調控元件及啟動子活性對分析轉錄起始水平上基因調控具有重要意義，在本研究中，序列分析表明在SaLDC啟動子-1～-594區段集中存在大量增強子元件GATA（-489，-287，-235，-119），增強效果疊加，對啟動子的活性具有顯著增強作用，對SaLDC啟動子缺失片段驅動的苦豆子愈傷組織的GUS瞬時表達發現，P310，P594驅動的GUS表達強度較高，也說明此段區域是啟動子調控的關鍵序列部分，預測結果與瞬時表達結果一致；在-806處存在1個抑制子WRKY710S[30]，由于該抑制子的存在，減弱了啟動子的活性，導致P924，P1260的愈傷組織GUS瞬時表達明顯減弱；此外，隨著SaLDC啟動子自身序列長度的增加，啟動子序列中存在的大量順式作用元件，影響了下游結構基因的表達水平。由于GUS瞬時表達結果只是短暫的高水平的表達，表達水平不長久也不穩定，因此對于SaLDC啟動子功能與特性的進一步研究，例如其大量順式作用元件功能的驗證，還需獲得穩定表達的轉基因株系。

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[責任編輯 呂冬梅]