丹參酮ⅡA磺酸鈉在缺血性斑馬魚模型中的促血管新生作用

陳 飛， 喬 祺， 王張生， 許 澎， 陸 剛

1.復旦大學附屬上海市第五人民醫院心血管內科，上海 200240 2.復旦大學附屬上海市第五人民醫院急診科，上海 200240

·論 著·

丹參酮ⅡA磺酸鈉在缺血性斑馬魚模型中的促血管新生作用

陳 飛1， 喬 祺1， 王張生1， 許 澎1， 陸 剛2*

1.復旦大學附屬上海市第五人民醫院心血管內科，上海 200240 2.復旦大學附屬上海市第五人民醫院急診科，上海 200240

目的： 觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉 (Tan ⅡA)對缺血性斑馬魚模型的促血管新生作用及其潛在機制。方法： 用內皮細胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VRKI)誘導血管損傷斑馬魚模型，分別予以50、100、200 μmol/L的Tan ⅡA處理。觀察Tan ⅡA在上述濃度下對缺血性斑馬魚腸下靜脈血管(SIVs)和節間血管(ISVs)的影響，并利用real-time PCR技術檢測flt-1、flk-1A (kdrl)、flk-1B(kdr)3個調節血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)信號通路相關基因的表達變化。 結果： 在VRKI誘導的血管損傷斑馬魚模型中，Tan ⅡA呈濃度依賴性地逐漸恢復ISVs和SIVs血管；通過VEGF通路上的相關基因[flt-1、flk-1A (kdrl)、flk-1B(kdr)]進行調控。 結論： 在缺血性斑馬魚模型中，Tan ⅡA可通過VEGF信號通路發揮其促血管新生和保護血管作用。

丹參酮ⅡA磺酸鈉; 血管新生; 斑馬魚; 血管內皮生長因子

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)作為中國傳統中藥，具有活血祛瘀、通經止痛、涼血消癰等功效。丹參是復方丹參滴丸(已通過全球9個國家127個臨床中心的Ⅲ期臨床試驗并得到FDA認可)的主要成分，其諸多單體和復方制劑廣泛應用于冠心病、缺血性卒中等疾病。其中丹參酮ⅡA是丹參的主要活性成分(脂溶性)，經過能夠提高水溶性的磺酸化結構修飾之后[1]，成為丹參酮ⅡA磺酸鈉(Tan ⅡA)。Tan ⅡA在臨床上已廣泛應用于冠心病、心絞痛、心肌梗死，近年來也用于室性早搏。研究[2-5]證實，Tan ⅡA具有血管新生雙向調節機制，其可通過抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達來抑制乳腺癌細胞株的細胞增殖和血管擬態形成，進而抑制腫瘤血管新生；另一方面其具有促血管新生作用。

斑馬魚普遍用于多種藥物的篩選中[6]。研究[7]表明，斑馬魚血管系統及其對調節血管新生的藥物治療反應與哺乳動物類似。雖然Tan ⅡA已用于多種細胞和動物模型，但其在缺血性模型中的應用較少。因此，本研究應用內皮細胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(vascular endothelial growth factor receptor kinase inhibitor Ⅱ, VRKI)誘導血管損傷轉基因斑馬魚Tg(fli1α∶EGFP)y1模型，觀察了Tan ⅡA對此模型血管新生的作用，并初步探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物 轉基因斑馬魚Tg(fli1α∶EGFP)y1由中國科學院生物化學與細胞生物學研究所斑馬魚技術平臺提供。

1.2 藥物、試劑與儀器 Tan ⅡA購于上海永恒生物科技有限公司，溶解于DMSO中配制為50 mmol/L的儲備液。 VRKI購于美國Calbiochem公司(Cat. No. 676481)，溶解在DMSO中配制為500 μg/mL的儲備液，-20℃儲存。紫外可見光分光光度計(UV 8453 Agilent Technologies)、奧林巴斯旋轉盤共聚焦顯微鏡系統購自日本Olympus公司。

1.3 健康轉基因斑馬魚模型實驗 選擇狀態良好，發育至24 h的轉基因斑馬魚Tg(fli1α∶EGFP)y1胚胎，除去卵殼，將其放入含有飼養液(0.2%DMSO)的24孔板中(每孔不少于15個)。Tan ⅡA組分別為50、100、200 μmol/L的Tan ⅡA， 對照組僅以0.2%DMSO為飼養液。兩組均放入28.5℃的飼養箱里飼養。48 hpf(hours post fertilization)時，清洗24孔板上的加藥孔，重新加入飼養液和不同濃度的Tan ⅡA。72 hpf時，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚腸下靜脈血管(subintestinal veins, SIVs)及節間血管(intersegmental vessels, ISVs)的狀態。

1.4 VRKI誘導血管損傷轉基因斑馬魚模型實驗 選擇狀態良好，發育至21 h的斑馬魚胚胎，除去卵殼，將其放入含飼養液(0.2%DMSO)的24孔板中(每孔不少于15個)。對照組僅以飼養液培養；VRKI組預先在飼養液中加入VRKI 500 ng/mL，在飼養箱里處理3 h后，以0.2%DMSO清洗3～4遍，繼續以0.2%DMSO培養；Tan ⅡA組分別為50、100、200 μmol/L的Tan ⅡA，在飼養箱里處理3 h，以0.2%DMSO清洗3～4遍后，再加入不同濃度Tan ⅡA。3組放入28.5℃的飼養箱里。48 hpf時，清洗24孔板上的加藥孔，重新換液加藥。72 hpf時，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚SIVs及ISVs的影響。

1.5 Real-time PCR檢測基因表達 選擇狀態良好，發育至21 h的斑馬魚胚胎，除去卵殼，將其放入含飼養液(含VRKI 500 ng/mL)的12孔板中(每孔不少于30個)，在飼養箱里處理3 h，用飼養液清洗3～4遍，再加入Tan ⅡA處理24 h，然后提取不同濃度組別的RNA。每組至少30條胚胎，利用RNeasy Mini Kit (美國Qiagen)將RNA反轉錄到cDNA，利用7500 Real-time PCR系統(美國Applied Biosystems)進行擴增PCR和基因表達檢測實驗(美國Invitrogen)。斑馬魚β-actin-1引物為5′-CAA GAT TCC ATA CCC AGG AAG GA-3′(F) 和5′-CAA GAT TCC ATA CCC AGG AAG GA-3′(R); 斑馬魚flk-1A(kdrl)引物為5′-GAC CAT AAA ACA AGT GAG GCA GAA G-3′(F) 和5′-CTC CTG GTT TGA CAG AGC GAT A-3′(R); 斑馬魚flk-1B(kdr)引物為5′-CAA GTA ACT CGT TTT CTC AAC CTA AGC-3′(F)和5′-GGT CTG CTA CAC AAC GCA TTA TAA C-3′(R); 斑馬魚flt-1引物為5′-AAC TCA CAG ACC AGT GAA CAA GAT C-3′(F) 和5′-GCC CTG TAA CGT GTG CAC TAA A-3′(R)。

2 結 果

2.1 Tan ⅡA對健康斑馬魚SIVs的影響 72 hpf時，健康轉基因斑馬魚中，50、100、200 μmol/L Tan ⅡA并沒有引起正常斑馬魚SIVs區域的異常變化；對照組SIVs區域是1個類似于籃網的光滑拱形結構，內部有4～6根血管(圖1)。Tan ⅡA組拱形血管外圍未出現與對照組具有顯著差異的尖銳出芽血管，說明在最高無毒濃度(200 μmol/L)下，Tan ⅡA并不會干擾斑馬魚機體自身的血管新生平衡，安全性較好。

2.2 Tan ⅡA對VRKI誘導的血管損傷斑馬魚模型胚胎血管的保護作用 72 hpf時，在VRKI誘導的血管損傷轉基因斑馬魚模型中，對照組的SIVs區域是一個類似于籃網的光滑拱形結構，內部有4～6根血管(圖2A紅色框內)；ISVs區域完整，平均血管數目為27根，完好連接DA和DLAVs(圖2A黃色框內)。而VRKI組ISVs和SIVs以及DLAVs都出現了明顯的缺失，平均有(0.74±0.56)根完整ISVs及(3.40±1.45)根非完整型ISVs。Tan ⅡA組處理48 h后，SIVs及ISVs均逐漸恢復，并呈濃度依賴性(圖2A)。尤其在200 μmol/L Tan ⅡA組中，完整ISVs平均有(23.55±1.04)根，非完整ISVs平均有(3.36±1.97)根，與對照組接近(圖2B)。另外，Tan ⅡA組處理48 h與24 h的血管數目明顯增多，說明Tan ⅡA不僅對VRKI誘導前期的血管有保護作用，也在后期起到促血管新生作用。

2.3 Tan ⅡA對VEGF關鍵基因mRNA影響的real-time PCR檢測結果 為了確定Tan ⅡA在缺血性斑馬魚模型中的安全性和促血管新生作用，進一步用real-time PCR分析VEGF信號通路上幾個關鍵基因的表達變化。結果(圖3)顯示：在健康斑馬魚模型中，與對照組相比，Tan ⅡA在50、100、200 μmol/L濃度下均沒有引起flk-1A、 flk-1B、flt-1 mRNA的基因表達變化(圖3A)。在VRKI誘導的缺血性斑馬魚模型中，Tan ⅡA呈劑量依賴性地逆轉由VRKI引起的flk-1A、flk-1B、flt-1 mRNA的基因表達下降。其中，200 μmol/L Tan ⅡA處理后flk-1A表達是VRKI組的2.32倍(P<0.05), flk-1B是1.79倍(P<0.05)，flt-1是2.78倍(P<0.01，圖3B)。這些結果表明，Tan ⅡA不會引起正常斑馬魚的基因表達變化，較安全；而在VRKI誘導的缺血斑馬魚模型中，Tan ⅡA能夠逆轉3個VEGF關鍵基因的表達下調，進而促血管新生。

圖2 丹參酮ⅡA磺酸鈉(Tan ⅡA)對VRKI誘導Tg(fli1α∶EGFP)y1斑馬魚ISVs和SIVs血管損傷模型的保護作用

圖3 丹參酮ⅡA磺酸鈉(Tan ⅡA)對健康及VRKI誘導Tg(fli1α∶EGFP)y1斑馬魚VEGF相關基因表達的影響

3 討 論

在我國，缺血性心臟病已成為僅次于腦血管疾病的第二大致死疾病，嚴重影響我國人民健康和生命安全。其中，男性中每10萬人就有137.6人死于缺血性心臟病，而女性也有95.1人死于此病[8]。而血管新生不足是缺血性心臟病的共同病理基礎。大量藥理和臨床研究已表明，活血化瘀類中藥對諸多缺血性疾病有一定的療效，其中Tan ⅡA已在臨床上廣泛應用。Tan ⅡA是改善微循環的常用藥，但其在血管新生方面的研究較有限。本研究觀察了Tan ⅡA對斑馬魚模型的促血管新生作用，并初步探討其可能的機制。

在斑馬魚發育過程中，其腦部血管在初期就有著極其復雜的蜂窩狀網絡結構，而在后期能衍生出更加復雜且難以觀察的血管，這不利于我們實驗觀察。但斑馬魚的SIVs和ISVs區域內血管在發育初期清晰可見，利于觀察和統計，較易獲得客觀可信的實驗結果[9]。在健康斑馬魚模型中，將SIVs的光滑拱形結構外圍出芽作為血管新生的評判依據[10]。研究[11]發現，VRKI能引起斑馬魚SIVs和ISVs區域的丟失，并使斑馬魚胚胎的血管新生過程受阻。由此，本研究利用VRKI來建立血管損傷斑馬魚模型。在此基礎上，探討Tan ⅡA對VRKI損傷血管的保護和修復效果，為進一步評價Tan ⅡA在缺血性心臟病、冠心病以及局部缺血、植入手術等提供理論依據。VEGF受體(VEGFRs)在血管新生過程中起促進作用[12]，調節VEGFR1的flt-1基因以及VEGFR2的flk-1A(kdrl)、flk-1B(kdr)基因作為VEGFRs的關鍵基因，均被作為目標基因檢測。本研究結果表明：在健康轉基因斑馬魚模型中，Tan ⅡA并不會明顯刺激SIVs區域出芽，也未引起flt-1、flk-1A(kdrl)和flk-1B(kdr)基因的表達變化，因此不會干擾血管新生平衡，說明安全性較好，與研究[13-15]結果一致；而在VRKI損傷模型中，Tan ⅡA顯示了強效的恢復ISVs和SIVs的效果。

綜上所述，本研究表明Tan ⅡA在缺血性斑馬魚模型中通過上調VEGF信號通路上flt-1、flk-1A(kdrl)、 flk-1B(kdr)表達來促血管新生和保護血管，且安全性良好，為臨床應用提供了理論依據。

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[本文編輯] 姬靜芳

The angiogenic effect and potential mechanism of sodium tanshinone ⅡA sulfonate in ischemic zebrafish model

CHEN Fei1, QIAO Qi1, WANG Zhang-sheng1, XU Peng1, LU Gang2*

1. Department of Cardiology, the Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China 2. Department of Emergency, the Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China

Objective： To investigate the angiogenic effect and potential mechanism of sodium tanshinone ⅡA sulfonate (Tan ⅡA) in ischemic zebrafish model. Methods： Vascular endothelial growth factor receptor kinase inhibitor (VRKI) was used to induce vascular injury in zebrafish model. Then the ischemic zebrafish model was treated with 50, 100, 200 μmol/L Tan ⅡA, respectively. The effects of Tan ⅡA on ischemic zebrafish subintestinal veins (SIVs) and intersegmental vessels (ISVs) were observed. Meanwhile, the expression changes of three vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway-related genes (flt-1, flk-1A, flk-1B) were detected by real-time PCR. Results： In VRKI-induced vascular injury zebrafish model, Tan ⅡA gradually restored ISVs and SIVs in a concentration-dependent manner, reversed the down-regulated expressions of three key VEGF signaling pathway-related genes (flt-1, flk-1A, flk-1B), and promoted angiogenesis. Conclusions： In the ischemic zebrafish model, Tan ⅡA plays a role in angiogenesis and vascular protection by regulating VEGF signaling pathway.

sodium tanshinone ⅡA sulfonate; angiogenesis; zebrafish; vascular endothelial growth factor

2016-09-07 [接受日期] 2017-01-03

陳 飛, 碩士, 主治醫師. E-mail: chenmilan@hotmail.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-24289511, E-mail: xiaogangg@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160674

R 285

A