急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞檢測及其對細胞凋亡的作用

吳瓊，王小中

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞檢測及其對細胞凋亡的作用

吳瓊，王小中

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

目的研究CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞在急性白血病患者外周血中的檢測，并探討其對細胞凋亡的作用。方法將65例急性白血病患者(包括急性淋巴細胞性白血病33例和急性髓系白血病32例)分為未緩解組(28例)和緩解組(37例)，25例健康志愿者作為對照組。根據是否合并感染又分為合并感染組(39例)和未合并感染組(26例)。采用細胞內染色的流式細胞術及熒光定量PCR的方法，分別在蛋白質和mRNA水平檢測Foxp3表達，并與正常對照組進行比較。同時，利用熒光定量PCR的方法的檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax、P53的表達。結果與正常對照相比，急性白血病患者（未緩解組和緩解組）外周血中CD4+CD25+Foxp3+比例明顯提高，且治療緩解后CD4+CD25+Foxp3+表達下調（P＜0.05）。凋亡相關基因Bcl-2表達上調，Bax、P53表達下調。結論急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞明顯升高，并且，影響凋亡相關基因Bcl-2、Bax、P53的表達，提示CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞可能通過細胞凋亡信號通路影響急性白血病的發展。

急性白血病；流式細胞術；CD4+CD25+Foxp3+；調節性T細胞；細胞凋亡

急性白血病是一類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病，是常見的血液惡性腫瘤，多種免疫機制參與白血病的發生發展過程。在抗腫瘤免疫效應中，細胞免疫比體液免疫起著更為重要的作用[1]。CD4+CD25+調節性T細胞是（T regulatory cells， Treg)具有抑制自身免疫反應、阻止損傷性免疫病理發生和維持機體免疫平衡作用的T細胞亞群，具有抑制細胞免疫，并誘導腫瘤免疫逃逸作用[2]。轉錄因子FoxP3是Treg的特異表面標志，參與維持其發育和功能，其表達水平能更為精確地反映CD4+CD25+Treg的活性[3，4]，是Treg檢測的關鍵標志之一[5]。本研究采用流式細胞術(flowcytometry，FCM)進行細胞內染色，檢測細胞核內表達的Foxp3分子，并結合PCR反應的高度特異性和靈敏性進行共同檢測，同時，對細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax、P53的mRNA采用PCR方法進行檢測，旨在研究急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達情況，為進一步研究CD4+CD25+Foxp3+促進急性白血病發生發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病例選擇2014年2月-2015年12月間在江西省南昌大學第二附屬醫院院血液內科住院的65例急性白血病患者，其中男34例，女31例，年齡18～55歲(38.12±13.58歲)。25例在我院體檢的健康志愿者(男15例，女10例，年齡30.21±13.31歲)作為對照組。所有病例均經臨床、骨髓形態學、細胞化學染色及免疫分型確診。其中急性淋巴細胞白血病(ALL)33例，急性髓系白血病(AML)32例。按治療效果分類，28例未達到完全緩解，納入白血病未緩解組，37例通過規范化療已經達到完全緩解，納入白血病緩解組。在這65例患者中，取血時出現合并感染(包括消化道感染、肺部感染和口腔黏膜感染等)的有39例，無明顯感染征象的26例。所有標本取血前均征得患者本人知情同意。

1.2 主要試劑熒光標記的抗體：PE標記的抗人CD4、PE-Cy5標記的抗人CD25及FITC標記的抗人Foxp3試劑盒(含配套的固定和透膜試劑)均購自EB ioscience公司；淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)；RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen)；逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒(Takara)。

1.3 細胞表面及細胞內染色采集外周血2ml加入EDTA抗凝管，充分混勻；準備兩根流式管，標明同型對照管和檢測管，分別用1、2表示；取外周血100μl分別加入兩管，1、2管都加入CD4-FITC/ CD25-APC各20μl，暗室室溫避光孵育20min；避光孵育后加入稀釋的溶血素和破膜劑，反應后以破膜緩沖液洗滌并重懸，1管加入IgG-PE 5μl，2管加入Foxp3-PE 20μl，暗室室溫避光孵育20min；加入5ml PBS緩沖液洗滌，1200r/min離心5min去上清。加入400μl PBS緩沖液上機檢測。

1.4 流式細胞儀檢測用FSC/SSC參數先找到淋巴細胞群，找到CD4+CD25+雙陽細胞群，IgG-PE為同型對照，使用對照管調整補償和電壓，使得陰性細胞群位于點圖的左下角，收集至少10000個細胞，以CD4+CD25+雙陽細胞射門，分析Foxp3的百分率，在計算機上用Cell Quest軟件分析數據，減去陰性對照管的非特異性對照值。

Foxp3+在CD4+中的比例分析：步驟同上，1，2管破膜之前只要加入CD4-FITC 20μl，用FSC/SSC參數先找到淋巴細胞群，找到CD4+陽性細胞群，IgG-PE為同型對照，使用對照管調整補償和電壓，使得陰性細胞群位于點圖的左下角，收集至少10000個細胞，以CD4+陽性細胞射門，分析Foxp3的百分率，在計算機上用Cell Quest軟件分析數據，減去陰性對照管的非特異性對照值。

1.5 定量PCR的檢測

1.5.1 總RNA抽提及逆轉錄反應采用Trizol試劑提取外周血單個核細胞總RNA，取總RNA 2μg進行逆轉錄反應合成cDNA。其中RNA的質量通過Nanodrop儀進行定性和定量檢測。

1.5.2 熒光定量PCR檢測Foxp3 mRNA表達取上述cDNA，采用Takara公司SYBR Green Taq試劑盒進行熒光定量PCR反應，總體積為10μl，按試劑說明書操作。Foxp3的表達水平以其與內參β-actin的比值表示。所用定量PCR儀型號為羅氏Lightcycler。引物由上海生工合成，引物序列見表1。PCR程序設定：預變性95°C 3min，變性95°C 30s，退火56°C 30s，延伸72°C 30s，35個循環，4°C保存。

1.6 統計處理采用SPSS軟件進行統計學處理，多組及組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達應用流式細胞術雙標記技術檢測急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+的表達，結果發現，與正常對照相比，急性白血病患者（未緩解組和緩解組）外周血中CD4+CD25+Foxp3+比例明顯提高，且治療緩解后CD4+CD25+Foxp3+表達下調（P＜0.05）（見圖1和表2）。進一步用熒光定量PCR方法檢測Treg表面Foxp3基因的mRNA的表達情況，結果與流式細胞術檢測結果一致，見圖2。這一結果提示CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達與急性白血病有一定相關性，并且可能與急性白血病的治療緩解相關。

圖1 流式細胞術檢測急性白血病患者外周血Foxp3的表達

圖2 熒光定量PCR檢測急性白血病患者外周血中Foxp3 mRNA表達

表2 流式細胞術檢測急性白血病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例(%)

2.2 合并感染組和未合并感染組患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的的表達比例在上述基礎之上，根據是否合并其它感染，將65例急性白血病樣本分合并感染組和未合并感染組。流式細胞術雙標記檢測合并感染組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例為4.63±0.49%，未合并感染組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例為4.36±0.56%，兩組之間的差異無統計學差異，見表3。

表3 合并感染組和未合并感染組患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例(%)

2.3 細胞凋亡相關基因Bcl2、Bax、P53 mRNA表達水平檢測Treg在細胞凋亡中起著非常重要的作用[6]，為此，我們通過熒光定量PCR方法檢測了凋亡通路中的重要基因Bcl2、Bax、P53的表達，結果顯示，在急性白血病患者（緩解組及未緩解組）中Bcl2表達上調、Bax及P53表達下調（見圖3）。

圖3 熒光定量PCR檢測急性白血病患者及健康對照組外周血中Bcl2、Bax、P53基因mRNA表達

3 討論

急性白血病是造血干細胞異常分化的克隆性惡性疾病，嚴重威脅人類健康。Tregs是一種專職抑制細胞，具有獨特免疫調節作用，人類主要由胸腺體天然產生Tregs，占人外周CD4+T細胞總數的5%～10%[7]，其表面表達有CD25、CTLA-4、GITR和Foxp3等分子。其主要功能是維持內環境穩定、抑制機體對同種異體移植物的排斥反應以及影響其他T細胞的功能等[8]。目前有關CD4+CD25+與腫瘤的關系有了大量研究，在胃癌、乳腺癌、肝癌等實體腫瘤患者的外周血和腫瘤局部，CD4+CD25+Treg的數量都比正常人明顯增高，并且，其數量與病人腫瘤的進展程度以及預后呈負相關[9-11]。有關CD4+CD25+Treg的研究也存在一定的不一致性，這有可能與CD4+CD25+不能完全代表Treg細胞與腫瘤的相關性有關[12]。Foxp3屬于foxhead家族分叉頭/翼狀螺旋轉錄調節因子，是細胞獲得性的關鍵轉錄因子，目前認為Foxp3是Treg的特異性標志，其表達正常是CD4+CD25+Treg發揮作用的重要前提[13]。

為此，我們收集了江西地區的65例急性白血病患者和25例正常體檢患者，采用雙標記流式細胞術技術和熒光定量PCR技術，檢測了CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達。結果提示，急性白血病患者（未緩解組和+緩解組）外周血中CD4+CD25+Foxp3+比例比正常對照組明顯提高，且治療緩解后CD4+CD25+Foxp3+表達下調（P＜0.05）。進一步設計采用熒光定量PCR方法檢測Treg表面Foxp3+基因的mRNA的表達，結果與流式細胞術檢測結果一致。本研究提示CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達與急性白血病有一定相關性，并且可能與急性白血病的治療緩解相關。白血病患者由于骨髓造血系統異常，導致免疫力下降，易于發生各種并發感染，本研究將收集的65例急性白血病患者分為合并感染組和未合并感染組，比較兩組患者中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達比例，由于可能本研究病例數尚少，未見差異具有統計學意義，有待進一步收集樣本，在更大范圍內檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg在急性白血病患者中的表達。

Treg細胞在調節細胞凋亡方面起著重要作用[6]，為了進一步研究CD4+CD25+Foxp3+Treg對急性白血病的調節機制，我們采用熒光定量PCR檢測了細胞凋亡信號通路中的關鍵基因Bcl-2，Bax，P53的mRNA的表達，結果發現，Bcl-2在急性白血病中表達上調，而Bax及P53表達下調。Bcl-2是體內的重要抑制凋亡基因，能阻斷凋亡信號傳遞的最后通路而抑制凋[14]，Bax及P53是細胞內促凋亡基因，這一研究結果提示CD4+CD25+Foxp3+Treg有可能通過抑制細胞凋亡促進急性白血病發生發展。Foxp3作為一種轉錄因子，定位于細胞內，絕大多數文獻報道的檢測手段是采用Western blot檢測其蛋白質的表達水平[15]。本實驗我們建立了流式細胞術合并熒光定量PCR共同檢測Foxp3的方法，這兩種方法均是可大范圍的運用于臨床的，該方法學的建立，可將為CD4+CD25+Foxp3+Treg外周血檢測在臨床推廣應用。

本研究為進一步認識CD4+CD25+Foxp3+Treg在急性白血病中的作用提供了實驗依據，為急性白血病患者的診斷和預后提供了可供選擇的新思路，但急性白血病細胞對CD4+CD25+Foxp3+Treg進行精細調節以及哪些藥物可以通過靶向CD4+CD25+Foxp3+Treg達到抑制或治療急性白血病，這些問題均有待后續進一步深入研究。

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Peripheral Blood Cd4+Cd25+Foxp3+Regulatory T Cells Detection And Its Effect On Cell Apoptosis In Acute Leukemia

WU Qiong，WANG Xiaozhong.
Department of Clinical Laboratory，Second Affiliated Hospital，Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Objective To study the detection of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in cute leukemia patients’peripheral blood，and discuss its influence on cell apoptosis.Methods Sixty-five cases of patients with acute leukemia(including 33 cases of acute lymphocytic leukemia and 32 cases of acute myeloid leukemia)were divided into un-relieved group(28 cases)，completely relieved group(37 cases).And 25 healthy volunteers were selected as control group.According to whether accompanied with infection，65 cases of patients were also divided into leukemia accompanied with infection group(39 cases)and not accompanied with infection group(26 cases).Compared to normal control group，FoxP3 expression was detected in the protein and mRNA level using flow cytometry(FCM)and fluorescent quantitative PCR(qPCR)methods.At the same time，apoptosis related genes Bcl-2，Bax，P53 were detected by qPCR.Results Compared with normal controls，peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+proportion increased significantly in the patients with acute leukemia(un-relieved group and completely relieved group).And CD4+CD25+Foxp3+expression reduced after therapy(P＜0.05).As cell apoptosis related genes，Bcl-2 was unregulated，while Bax and P53 were down regulated. Conclusion CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells are upregulated in acute leukemia patients’peripheral blood，and cell apoptosis related genes were influenced，indicating that CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells influence the development of acute leukemia through apoptosis signaling pathways.

∶Acute leukemia；Flow cytometry；CD4+CD25+Foxp3+；Regulatory T cells；Cell apoptosis

R733.7，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0304-04

2016-11-24；

2017-05-17)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.004

江西省自然科學基金項目，編號：2014ZBAB205010

吳瓊，女，1984年生，主管技師，流式細胞術。

王小中，男，1973年生，主任技師，教授，主要從事臨床檢驗診斷學。