全自動固相萃取-高效液相色譜法測定花生油中黃曲霉毒素B1

劉蘭，周培華

(廣西壯族自治區玉林食品藥品檢驗所，廣西玉林537000)

全自動固相萃取-高效液相色譜法測定花生油中黃曲霉毒素B1

劉蘭，周培華

(廣西壯族自治區玉林食品藥品檢驗所，廣西玉林537000)

目的建立花生油中黃曲霉毒素B1的快速準確檢測方法。方法以四通道全自動固相萃取儀(Automated Solid Phase Extraction Apparatus，ASPEA)對樣品提取液進行自動凈化，再通過高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)帶熒光檢測器，聯合柱后衍生儀對花生油樣品中所含有黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)進行測定。結果顯示黃曲霉毒素B1的工作曲線為：Y=531.92X-387.02；r=0.9991。方法的重復性RSD=2.18%；方法精密性RSD=1.58%。測定樣品黃曲霉毒素B1含量濃度為1.632μg/kg～81.6μg/kg；加標回收率為90.3%～110.8%。結論所建立方法快速靈敏，綠色環保，9min完成分析，適合多批次食品中黃曲霉毒素B1的快速準確檢測。

全自動固相萃取儀；黃曲霉毒素B1；重復性；精密度；回收率

黃曲霉毒素為真菌黃曲霉菌和寄生曲霉的次級代謝產物，其毒性在所有真菌毒素和化學毒物中為最強，是世界公認的分布最廣，危害最大的一類毒素，可分為B1，B2，G1，G2和M1等18種，其中B1的毒性最強，是目前已知的毒性最強的致癌物，屬Ⅰ類致癌物[1，2]。對人體肝臟細胞有損害作用，可誘發肝癌的發生[3，4]。通過隨機抽樣及試驗檢測，發現黃曲霉毒素B1易存在于霉變的堅果、糧油中，如花生、玉米及其制品花生油、玉米粉，偶見于陳皮，少見于大米、米粉、腐竹等食品中。黃曲霉毒素B1的檢測方法包括薄層色譜法[2]、酶聯免疫吸附法[1，2，5]、高效液相色譜法[6，7]、高效液相色譜串聯質譜法[8-10]、以及基于核酸熒光的先進測定方法[11，12]。本文改進了高效液相色譜帶熒光檢測器及柱后衍生儀對黃曲霉毒素B1的含量進行測定的方法[13]，采用了全自動固相萃取裝置對樣品提取液通過免疫親和柱的自動凈化。國家標準對食品中黃曲霉毒素B1的含量限度大多在5～20μg/kg[14]。隨著新的食品安全法的頒布實施，對食品安全要求更加嚴格，國家對食品安全的監管力度加強，抽檢范圍覆蓋廣，抽檢批數多，準確和快速的測定方法是必須的。當然隨著科技的發展，國內近年來也涌現出一些控制產品中黃曲霉毒素的含量和對食品中存在的黃曲霉毒素的降解方面的相關研究[15，16]。本實驗通過試驗建立對花生油中黃曲霉毒素B1的含量進行了測定的快速，高效，準確的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料黃曲霉毒素B1對照品為國家糧食局科學研究院，批號：GBW（E）090015a，濃度為1.02μg/ml；固相萃取免疫親和柱Beacon公司，規格為300ng，3ml；色譜純甲醇Thermo Scientific；水為超純水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備ML3002電子天平METTLER TOLEDO；GX-274 ASPEC四通道全自動固相萃取儀GILSON；U3000高效液相色譜儀Thermo Scientific；柱后衍生儀Pickering Pinnacle；超純水系統Millipore Synergy；VXR B S25基本型振蕩器IKA；G560E漩渦震蕩儀。

1.3 樣品花生油(散裝和預包裝)樣品來自玉林、貴港市區及轄區各縣。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件高效液相色譜儀：Thermo C18反相色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相配比為甲醇：水=55：45，流速為0.8ml/min，柱溫為30℃；熒光檢測器激發波長為360nm，發射波長為450nm；進樣量為10μl。

柱后衍生儀：碘液濃度為0.05%，流速為0.2ml/min，衍生反應溫度為70℃。

1.4.2 對照品溶液制備精密吸取黃曲霉毒素B1對照品溶液1ml置25ml容量瓶，用甲醇稀釋定容到刻度，搖勻，即得儲備液為40.8ng/ml。再分別精密吸取不同體積到10容量瓶，用甲醇稀釋定容到刻度，搖勻，得到系列濃度為0.408ng/ml到40.8ng/ ml的標準工作溶液。檢出限濃度為0.408ng/ml，折算為S/N=3時，方法實際檢出限為0.2μg/kg，標準檢出限為1μg/kg。

1.4.3 供試品溶液制備樣品經過260r/min回旋振蕩器振搖30min混勻，再取樣。準確稱取經上述方法處理樣品25.00g至250ml具塞錐形瓶中，加入氯化鈉5.00g，再準確加入甲醇：水（7：3）125.0ml，經過260r/min回旋振蕩器振搖提取35min，定量濾紙過濾，棄去初濾液，準確移取續濾液15.0ml到50ml離心管中，加入30.0ml水稀釋，搖勻，即得。

1.4.4 供試品溶液凈化制備好的供試品溶液經過全自動固相萃取裝置按表1的條件，按上樣、淋洗雜質、洗脫順序凈化后，2ml洗脫液收集于2ml容量瓶，經過渦旋混勻后，再通過0.45μm的尼龍濾膜過濾，收集續濾液于進樣小瓶，以備高效液相色譜儀分析。凈化過程中的淋洗液為水，洗脫液為甲醇。

表1 全自動固相萃取儀萃取條件

2 結果

2.1 方法學

2.1.1 精密度取濃度為0.816ng/ml對照品溶液連續進樣6次，黃曲霉毒素B1衍生后色譜峰保留時間RSD=0.75%及色譜峰響應值按峰面積計算RSD=1.58%。數據顯示儀器的精密度良好。

2.1.2 重復性在檢出黃曲霉毒素B1的花生油樣品中，選取同一批次的樣品，取6份平行樣，經過提取，再經過自動固相萃取，凈化后的黃曲霉毒素B1衍生色譜峰保留時間RSD=1.03%及色譜峰響應值按峰面積計算RSD=2.18%。數據顯示樣品按本實驗條件處理重復性良好。

2.1.3 回收實驗在花生油的檢測中，黃曲霉毒素B1國家標準規定最高殘留限量（MRL）為20μg/kg[14]。選擇最低定量限，合適含量點，最高殘留限量3點，對應質量濃度分別為0.816ng/ml，4.08ng/ml， 10.2ng/ml做回收試驗，各取兩份樣加標。取樣量為25.00g，稀釋倍數為50倍。試驗結果見表2顯示回收率范圍為90.3%～110.8%。表明試驗方法可行性良好。

表2 回收率

2.2 樣品測定結果對所抽取的花生油205批次的樣品測定結果（見表3）進行統計，發現檢出批次及超過國家標準限度[14]的批次占所檢驗樣品的比率還是比較低，檢測超限的樣品主要來源于少數小作坊的自制壓榨散裝花生油。產生原因由于南方潮濕氣候導致原料發霉，以及壓榨器具長期使用沒有清洗。

表3 樣品測定結果

3 討論

3.1 流動相本實驗所用流動相為甲醇：水=55：45，流速為0.8ml/min，黃曲霉毒素B1保留時間為9min，且黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1之間達到所需分離度要求，主要是B1與相鄰的B2分離度達到要求（圖1、圖2）。在大批量檢測的時候，可以大量節約時間，保證結果的準確和及時性。

圖1 黃曲霉毒素B1液相色譜圖

圖2 黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1液相色譜圖

3.2 檢測波長在GB/T 17909-2003中選擇熒光檢測器具有激發波長為360nm，發射波長為420nm以上；在《中國藥典》中黃曲霉毒素檢測中選擇激發波長為360nm，發射波長為450nm，通過實驗，發射波長對測定結果數據影響不大。

3.3 實驗創新首先對照品溶液的配置及洗脫液選擇以甲醇代替苯乙腈，減少了對實驗人員的危害，凈化過程選擇全自動固相萃取裝置，可以提高效率，同時也減少試劑對實驗人員的危害。最后，在得到的流動相配比條件下黃曲霉毒素B1的保留時間為9min，可以快速準確測定樣品中黃曲霉毒素B1的含量。

最后，通過對多批次的花生油中黃曲霉毒素B1的測定，及結果數據分析，黃曲霉毒素B1的檢出率及不合格率是相對較低的，對于大多數市場生產和流通的花生油，可以放心食用，不必要對花生油中存在黃曲霉毒素B1產生恐慌。同時花生油的生產廠家應該做好花生油原材料的選擇、保存和壓榨器皿的衛生清潔工作。

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Determination of Aflatoxin B1 in Peanut Oil by High Performance Liquid Chromatography With Automated Solid Phase Extraction Apparatus

LIU Lan，ZHOU Peihua.
Yulin Institute for Food and Drug Contorl，Yulin Guangxi 537000，China.

Objective To establish a rapid and accurate method for detection of aflatoxin B1 in peanut oil.Methods This paper mainly introduces purifying aflatoxin B1 in the samples with the ASPEA(automated solid phase extraction apparatus).Then，test AFB1 with HPLC(high performance liquid chromatography)，the detector of HPLC is fluorescence detector which is linked with a post column derivatization which was installed before the detector.Results The results show the working curve of this experiment was as follows：Y=531.92x-387.02；r=0.9991.The repeatability and the precision expressed as RSD values were 2.18%and 1.58%.The concentration of AFB1 in the samples was range from 1.632μg/kg to 81.6μg/kg；rates of recovery were in the range of 90.3%to 110.8%for AFB1 in food.Conclusions This method can complete analysis within 9 min，and is suitable for fast，accurate and environmental friendly determination of AFB1 in multi-batch food.

∶Automated solid phase extraction；Aflatoxin B1；Repeatability；Precision；Rate of recovery

R155.5，TS207.3

A

1674-1129(2017)03-0312-03

2017-02-15；

2017-04-28)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.006

劉蘭，女，1986年生，工程師，工學碩士，主要從事食品藥品檢驗研究分析。E-mail：ll43091003@126.com