ING4在結腸和直腸的胃腸間質瘤表達的研究

彭芳，鐘斌，王建，張功亮，楊人澤

(1、贛州市人民醫院病理科，江西贛州341000；2、贛南醫學院第一附屬醫院藥劑科，江西贛州341000)

ING4在結腸和直腸的胃腸間質瘤表達的研究

彭芳1，鐘斌2，王建1，張功亮1，楊人澤2

(1、贛州市人民醫院病理科，江西贛州341000；2、贛南醫學院第一附屬醫院藥劑科，江西贛州341000)

目的研究ING4與結腸和直腸的胃腸間質瘤的惡性程度的關系。方法收集原發于結腸和直腸的胃腸間質瘤共62例，并用RT-PCR方法和免疫組織化學方法檢測ING4 mRNA和ING4蛋白在胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中的表達情況。結果RT-PCR技術測定胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4與β-actin光密度比值平均值分別為0.32、0.51、0.56和0.78胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4 mRNA的量也依次增加，差別有統計學意義（P＜0.05）。62例ING4免疫組織化學結果：高危組陽性3例（陽性率18.8%）；中危組陽性6例（陽性率26.1%）；低危組陽性10例（陽性率55.6%）；極低危組陽性3例（陽性率60%）。胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4蛋白表達陽性率也依次增加，差別有統計學意義（P＜0.05）。結論ING4可以作為一個新的評價胃腸道間質腫瘤惡性程度的指標。

ING4；胃腸間質瘤；RT-PCR；免疫組織化學

ING4基因是Shiseki M等[1]于2003年發現腫瘤抑制基因，它參與調節P53活性、腫瘤血管的增生、細胞對缺氧狀態的適應、細胞接觸抑制的丟失以及細胞對化學藥物敏感性等影響腫瘤的發生、生長及對腫瘤治療的多個方面[1-6]。胃腸間質瘤是胃腸道常見的間葉源性腫瘤，可發生于胃腸道的任何部位，這種腫瘤起源于間質的起搏細胞（Cajal細胞）[7]，這些起搏細胞穿插在腸壁平滑肌組織和自主神經系統之間[4，8]。本實驗在基因水平和蛋白水平探討ING4與結腸和直腸的胃腸間質瘤的惡性程度的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集我院2005年至2016年10月間原發于結腸和直腸的胃腸間質瘤共62例。男性38例，女性24例，年齡31～79歲，平均年齡55歲。51例腫瘤位于結腸，11例腫瘤位于直腸。41例患者表現為反復發作腹痛，查體發現腹部包塊，9例患者以消化道出血為首發癥狀就診，4例以腫瘤破裂合并急腹癥，8例患者體檢發現腫塊入院。腫瘤最大徑0.5～12cm，平均最大徑4cm。56例腫瘤邊界尚清楚，6例腫瘤破裂。其中黏膜下3例，肌壁間32例，漿膜外27例。腫物切面實性，灰紅色灰白色，部分區域呈魚肉狀，質中偏嫩，灶性區域囊性變伴出血壞死。根據腫瘤大小、核分裂像和有無腫瘤性壞死分為高危組、中危組、低危組和極低危組，其中高危組16例，中危組23例，低危組18例，極低危組5例。

1．2實驗材料ING4和β-actin引物購自天為時代科技（北京）有限公司，2×Taq PCR MasterMix購自天根生化科技（北京）有限公司，Trizol和Prime ScriptTMRT reagent kit購自寶生物工程（大連）有限公司。一抗兔抗人ING4多克隆抗體購自英國Abcom公司，兔鼠通用型免疫組化SP法檢測試劑盒及DAB顯色劑均購自福建邁新生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 RT－PCR方法總RNA提取：取約200mg組織，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol勻漿。震蕩30s。加0.2ml氯仿，劇烈地搖動30s，靜置3min。12000×g，4℃離心，15min。吸出上層無色水相，移入另一個EP管中（約0.5ml）。加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10min。12000×g，4℃離心，10min。在管底部可見微量RNA的沉淀，棄去上清，加75%乙醇1ml，振蕩。7500×g，4℃離心，10min。棄去上清，用濾紙吸取殘留液體，室溫下干燥5～10min。沉淀溶于20μl DEPC水中，-70℃保存。

1.3.2 計算總RNA提取樣品的純度與質量所有標本的OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.0之間，表明總RNA純度較高，沒有蛋白質殘留。總RNA變性瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：18S和28S的條帶清晰，隱約可見5S。提示RNA提取完整，無降解。

1.3.3 逆轉錄合成cDNA用Prime ScriptTMRT reagent kit，進行逆轉錄反應：

在0.1%DEPC處理的EP管中依次加入以下試劑：

5×PrimeScript Buffer2μl

PrimeScript RT Enzyme MIX I0.5μl

Oligo dT Primer0.5μl

Random 6mers0.5μl

Total RNA4μl

Rnase Free dH2O2.5μl

反轉錄反應條件：37℃水浴15min（逆轉錄反應），后置于85℃5sec（使反轉錄酶的失活反應）。置于-20℃冰箱凍存備用。

1.3.4 聚合酶鏈式反應（PCR）ING4基因檢測引物序列、產物長度和PCR反應條件，以β-actin作為對照。見表1、表2。

PCR反應體系

10×Buffer(15mM MgCl2)5.0μl

dNTP(2.0mM)4.0μl

上、下游引物各1.0μl

Taq酶0.5μl

模板(cDNA)5.0μl

用無核酶水定容至25.0μl

加無菌石蠟油25.0μl

表1 PCR引物序列

表2 PCR反應條件

1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳取擴增產物10μl點樣，2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色顯示，在透射紫外光分析儀下攝影，并用激光光密度圖象掃描儀掃描。

1.3.6 凝膠分析定量計算方法為：所得ING4擴增產物的條帶與β-actin擴增產物的條帶的綜合灰度之比代表mRNA的表達水平。

1.3.7 質量控制設立了空白對照組、陰性對照組和內對照組。空白對照：用DEPC水替代cDNA進行PCR擴增。陰性對照組：以RNA替代cDNA用于PCR擴增。內對照組：以β-actin引物，擴增的cDNA，證實提取的RNA產物是否可以用于擴增目的DNA。

1.3.8 免疫組織化學方法免疫組織化學試劑一抗采用英國Abcom公司生產的ING4多克隆抗體。檢測系統也采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。石蠟切片厚度3μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸泡5min，3%過氧化氫室溫孵育10min阻斷內源性過氧化酶的活性，PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復，自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑盒中試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應。蘇木素復染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍，脫水，透明，中性樹膠封片，每次均做陽性對照及PBS代替一抗做陰性對照。

1.3.9 免疫細胞化學判斷的標準定位準確，呈棕黃色顆粒為陽性，ING4陽性定位于細胞核，陽性細胞小于10%為（-），11%～25%為（+），26%～50%為（++），51%～75%為（+++），76%～100%為（++++）

1.4 統計分析方法RT-PCR實驗重復3次，RTPCR實驗的圖片用Image tool軟件進行灰度值分析，實驗數據采用t檢驗分析，P＜0.05為差別有統計學意義。實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件進行處理。

2 結果

2.1 RT－PCR方法檢測胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4mRNA的表達情況RT-PCR技術測定胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4mRNA表達情況（見圖1）。各組中ING4與β-actin光密度比值平均值分別為0.32、0.51、0.56和0.78（見表3）。胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4mRNA的量也依次增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4 mRNA表達情況（x±s）

圖1 胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4 mRNA表達情況

2.2 免疫組織化學方法檢測胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4蛋白的表達情況62例ING4免疫組織化學結果(見圖2)：高危組陽性3例（陽性率18.8%）；中危組陽性6例（陽性率26.1%）；低危組陽性10例（陽性率55.6%）；極低危組陽性3例（陽性率60%）。胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING蛋白表達陽性率也依次增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

ING4是2003年新發現的抑癌基因[1-3]。它參與調節P53活性、腫瘤血管的增生、細胞對缺氧狀態的適應、細胞接觸抑制的丟失以及細胞對化學藥物敏感性等影響腫瘤的發生、生長及對腫瘤治療的多個方面[4-12]。ING4蛋白和p53形成轉錄復合物，從而激活p53基因，介導細胞的生長和修復；HIF的異常表達或者激活后通過促進血管形成、糖酵解、細胞增生和分裂等過程促進腫瘤的發展，ING4直接和HIF的羥化，而抑制腫瘤生長[13，14]；過度表達ING4可以顯著負性調節處于G2M停止期細胞，而促進細胞凋亡[12-15]。

圖2 ING4免疫組織化學結果（×200）

本實驗采用RT-PCR方法和免疫組織化學的方法檢測ING4 mRNA和ING4蛋白在胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中的表達情況，發現胃腸道間質瘤高危組、中危組、低危組和極低危組中ING4 mRNA和ING4蛋白表達陽性率也依次增加，差別有統計學意義（P＜0.05）。

胃腸道間質瘤目前評價惡性程度主要是依據腫瘤部位、大小、核分裂像和有無腫瘤性壞死，而缺乏免疫組織化學指標的支持，本實驗結果證實隨著胃腸道間質瘤惡性程度的增加，ING4 mRNA和ING4蛋白的表達降低。ING4可以作為一個新的評價胃腸道間質腫瘤惡性程度的指標。

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R735.3，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0337-03

2016-12-26；

2017-05-01)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.013

江西省衛計委資助課題，編號：20167204

彭芳，女，1985年生，主治醫師，病理與病理生理學專業，碩士研究生。

楊人澤，男，1975年生，主任藥師，碩士學位。研究方向為醫院藥學和臨床藥學。