母乳、小兒血液及尿液標本中檢測巨細胞病毒對診斷小兒HCMV感染的臨床應用

謝康，劉艷秋，陽彥，陸青，夏秋平

(江西省婦幼保健院產前診斷中心，江西南昌330006)

母乳、小兒血液及尿液標本中檢測巨細胞病毒對診斷小兒HCMV感染的臨床應用

謝康，劉艷秋，陽彥，陸青，夏秋平

(江西省婦幼保健院產前診斷中心，江西南昌330006)

目的探討不同種類的標本中人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)的檢測對診斷小兒感染HCMV的價值。方法采用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，FQ-PCR）檢測458例臨床疑似HCMV感染的患兒尿液、血液和母乳中HCMV-DNA，運用化學發光發檢測患兒血清HCMV-IgM抗體水平，并進行統計分析。結果458例患兒中，母乳HCMV-DNA的總檢出率最高，達52.6%。新生兒組母乳HCMV-DNA陽性率（55.6%）明顯高于尿液（7.0%）和單個核細胞（13. 4%），也遠高于血清HCMV-IgM陽性率（4.2），差異均有統計學意義（P＜0.05）；嬰兒組尿液HCMV-DNA檢出率最高（59.8%），顯著高于單個核細胞HCMV-DNA（24.3%）和血清HCMV-IgM（22.2%）的陽性率，但與母乳HCMV-DNA（51.3%）陽性率無明顯差異（P＞0.05）。母乳HCMV-DNA與患兒尿液HCMV-DNA（r=0.778）、單個核細胞HCMV-DNA（r=0.395）及血清HCMVIgM（r=0.332）陽性率均呈顯著正相關。結論根據年齡段選擇HCMV的樣本送檢，對提高檢出率具有重要價值，聯合母乳、患兒尿液、單個核細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM檢測可明顯提高患兒HCMV感染檢測的陽性率。

人類巨細胞病毒；小兒；實時熒光定量PCR；化學發光法；母乳

人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種屬于具有雙鏈DNA的皰疹類病毒，具有高度種屬特異性和潛伏-活化的生物學特征[1]。該病毒在全球廣泛流行，發達國家的感染率為30%～70%，我國人群的感染率在90%以上，尤以孕婦、嬰幼兒等免疫功能低下的人群更為常見[2]。HCMV感染大多數表現為無癥狀的隱形或潛伏感染，該病毒是孕婦圍生期感染的重要病原微生物之一，可通過胎盤、血液或者母乳等途徑直接傳播給嬰兒，可導致胎兒畸形、流產、早產等，嚴重影響胎兒的健康；也可導致嬰兒黃疸、肝脾腫大、皮膚出血點及淤斑等，重癥病死率高，并可導致運動、聽力、視力及智力等多種嚴重的后遺癥[3，4]。因此，HCMV感染的早期診斷及預防顯得尤其重要。

本研究運用實時熒光定量聚合酶鏈反應法（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）檢測疑似HCMV感染小兒血、尿及母乳中HCMV-DNA含量，同時采用化學發光法檢測其血清HCMV-IgM水平，探討不同種類的標本不同檢測指標在小兒HCMV感染疾病中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2014年1月至2016年6月在江西省婦幼保健院疑似HCMV感染的住院患兒458例，年齡均≤1周歲，并按年齡分成兩組。其中新生兒組（0≤年齡≤28d）共142例，男83例，女59例；嬰兒組（29d≤年齡≤1周歲）共316例，男195例，女121例。

1.2 標本收集清潔患兒外陰，留取新鮮尿液2～5ml于干凈無菌試管中；母乳采集用自我擠壓法（不用吸奶器），清潔乳頭后擠出乳汁5ml于干凈無菌試管中，留取的標本立即送往實驗室，如不能立即檢測，標本置4℃冰箱中保存，24h內完成檢測。同時抽取患兒靜脈全血2ml（EDTA-K2抗凝）用于HCMV-DNA檢測，促凝管采集靜脈全血2ml用于HCMV-IgM檢測。

1.3 標本處理乳汁、尿液標本：充分混勻后吸取1ml于無菌離心管中，12000r/min離心5min，棄上清，取沉淀。抗凝管標本：混勻后取EDTA抗凝全血1ml，沿試管壁緩慢加入裝有淋巴細胞分離液的無菌試管中，1500r/min離心15min，吸取中間單個

1.4 試劑、儀器與樣本檢測FQ-PCR檢測采用中山醫科大學達安基因診斷公司CMV-DNA熒光定量試劑盒。實時熒光定量PCR擴增儀為美國ABI7500。上述標本處理后的母乳沉淀、尿液沉淀和單個核細胞沉淀分別加入DNA提取液混勻，100℃保溫10min，12000r/min離心5min，取上清5μl作PCR反應。循環條件為93℃2min預變性，93℃45s→55℃60s→共10個循環，最后按93℃30s→55℃45s→共30個循環，于55℃45s末收集熒光信號。根據陽性定量參考品的CT值作標準曲線，通過樣品的CT值計算DNA病毒載量，DNA拷貝數≥500copies/ml結果為陽性，DNA拷貝數＜500 copies/ml為陰性。HCMV IgM抗體檢測試劑盒和全自動免疫分析儀Cobas E-601均購自德國羅氏診斷有限公司，且HCMV-IgM≥1.0COI(cutoff index)為陽性。

1.5 統計學方法采用SPSS 19.0軟件處理數據，陽性率的比較采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法，陽性率相關性分析采用Spearman相關檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 458例疑似HCMV患兒中各種標本的陽性率比較如表1所見，458例疑似HCMV感染患兒中母乳標本HCMV-DNA的檢出率最高（52.6%），顯著高于單個核細胞HCMV-DNA（21.0%）及血清HCMV-IgM的檢出率（16.6%）（P＜0.05），但與尿液HCMV-DNA的檢出率（43.4%）無明顯差異（P> 0.05）。

2.2 新生兒組四種檢測標本HMCV陽性率的比較新生兒組中，142例疑似感染HCMV患兒的母乳標本中HCMV-DNA陽性率達55.6%，明顯高于尿液（7.0%）、單個核細胞（13.4%）及血清中HCMVIgM的陽性率（4.2%），P值均小于0.01。單個核細胞HCMV-DNA陽性率均高于尿液HCMV-DNA與血清HCMV-IgM的陽性率（P＜0.05），而尿液HCMV-DNA與血清HCMV-IgM的陽性率無統計學意義（P>0.05）（表1）。

2.3 嬰兒組四種檢測標本HMCV陽性率的比較表1中可見，嬰兒組中，316例疑似感染HCMV患兒的母乳HCMV-DNA陽性率與尿液HCMV-DNA陽性率差異無統計學意義，但均高于單個核細胞HCMV-DNA陽性率和血清HCMV-IgM的陽性率（P均小于0.01）。而后兩者間的陽性率差異無統計學意義（P>0.05）。

2.4 新生兒組和嬰兒組HCMV-DNA和HCMVIgM陽性率的比較表1中，除母乳HCMV-DNA陽性率差異無統計學意義外，新生兒組尿液HCMV-DNA、單個核細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM的陽性率均低于嬰兒組，且差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 HCMV-DNA與HCMV-IgM陽性率中的性別差異兩組患兒中，男性與女性間的母乳、尿液、單個核細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM陽性率的差異均無統計學意義，P值均大于0.05（表1）。

表1 458例小兒疑似HCMV感染母乳、尿液、單個核細胞及血清檢測情況

2.6 母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、單個核細胞HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率的相關性分析表2中可見，母乳檢測中HCMVDNA陽性的共有241例，陰性217例，陽性率52.6%。其中，在患兒尿液HCMV-DNA陽性的199例中，母乳HCMV-DNA陽性共178例，占89.4%（178/199），患兒尿液HCMV-DNA陰性的259例中，母乳HCMV-DNA陽性共64例，占24.7%（64/ 259），兩者差異顯著（P＜0.01）；在患兒單個核細胞HCMV-DNA陽性的96例中，母乳HCMV-DNA陽性88例，占91.7%（88/96），患兒單個核細胞HCMV-DNA陰性的362例中，母乳HCMV-DNA陽性共151例，占41.7%（151/362），兩者比較，P＜0.01，差異有統計學意義；在患兒血清HCMV-IgM陽性的76例中，母乳HCMV-DNA陽性67例，占88.2%（67/76），患兒血清HCMV-IgM陰性的382例中，母乳HCMV-DNA陽性共159例，占41.6%（159/382），兩者比較，P＜0.01，差異有統計學意義。進一步進行Spearman等級相關分析得出，母乳HCMV-DNA陽性率與患兒尿液HCMV-DNA陽性率（r=0.788，P＜0.01）、單個核細胞HCMV-DNA陽性率(r=0.395，P＜0.01)及血清HCMV-IgM陽性率（r=0.332，P＜0.01）均呈正相關。

3 討論

HCMV屬皰疹病毒β亞科，為雙鏈DNA病毒，又稱為人類皰疹病毒5型，其直徑約180～250 nm，在人群中感染十分普遍，尤其是孕婦、嬰幼兒等免疫功能低下的人群[5]，然而嬰幼兒感染HCMV早期很多無癥狀，呈隱形感染，將來有可能發展為智力低下，聽力受損等中樞神經系統損害[6，7]。隨著特異性抗CMV病毒更昔洛韋的應用，如何早期、快速而準確地診斷CMV感染成為監測CMV感染狀態、給予合理的治療及判斷療效、預后的關鍵。

表2 母乳HCMV-DNA與小兒尿液、單個核細胞HCMV-DNA及血清HCMV-IgM的相關性

目前，臨床檢測HCMV方法包括直接檢查、血清學診斷、病毒培養、抗原檢測、熒光定量PCR技術檢測母乳、血、尿DNA含量[8，9]。本研究根據患兒年齡進行分組，分別檢測新生兒組與嬰兒組母乳、尿液、單個核細胞中HCMV-DNA含量及血清中HCMV-IgM水平，并進行結果分析。結果顯示，458例疑似HCMV感染患兒中母乳標本HCMV-DNA的總陽性率高達52.6%，與國內文獻報道結果相近[10]，推測HCMV感染母乳可能是小兒感染HCMV的主要途徑之一。在新生兒組中，單個核細胞HCMV-DNA陽性率高于尿液HCMV-DNA和血清HCMV-IgM陽性率，差異統計學意義（P＜0.05），提示在新生兒疑似感染中同時檢測其母乳及外周血單個核細胞HCMV-DNA含量可提高檢出率，幫助早期診斷。HCMV最易侵犯腎臟等管道上皮細胞，并可在腎小球和腎小管上皮細胞內復制，隨尿液排出，因此可在尿液中檢測HCMV-DNA[11]。在嬰兒組中，尿液HCMV-DNA陽性率最高，顯著高于新生兒組，P＜0.01，這可能是與嬰兒組相比，新生兒腎臟濃縮功能還不健全，尿液中病毒被稀釋導致病毒含量非常低[12，13]，但具體機制還需進一步的研究。由此看來，在嬰兒疑似感染HCMV中，聯合檢測母乳和嬰兒尿液HCMV-DNA更有利于早期診斷。此研究為臨床提供了參考，可根據疑似患兒的年齡選擇送檢標本，以提高檢出率，達到早診斷早治療的目的。

由于母乳營養成分全面且含豐富的免疫成分，適合小兒生長發育的需要并能降低嬰兒感染感染性疾病的發生率。因此，母乳喂養一直被大力提倡。然而，近年研究發現母乳喂養是導致嬰幼兒巨細胞病毒感染的流行病學的主要因素[14]。本研究發現，母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、單個核細胞HCMV-DNA及血清HCMV-IgM陽性率均呈顯著性正相關（表2），與國內報道基本一致[15]，提示患兒感染HCMV與母乳傳播關系密切，證實了小兒HCMV感染可能來自母親，提高孕婦孕產前的HCMV檢查顯得十分重要。

不同標本、不同檢測方法均可對HCMV陽性結果造成影響。如表2所示，在母乳HCMV-DNA陽性的情況下，患兒尿液、單個核細胞HCMVDNA和血清HCMV-IgM均存在一定的陰性比例。其中，尿液HCMV-DNA假陰性可能與HCMV尿液間歇性排毒有關[16]，處于不排毒狀態時檢測的標本會產生與臨床診斷不符合的現象，因此需反復、連續、多次檢查尿液HCMV-DNA，以提高檢出率。另外，人體感染HCMV后3～5d即可出現HCMVIgM抗體，其陽性是診斷早期感染的可靠指標，并表明為活動性感染，但HCMV-IgM抗體在血液僅存在3～6個月，臨床實驗室檢測陽性率較低，并且由于免疫抑制效應，機體的免疫功能低下，新生兒和嬰兒產生HCMV-IgM的能力較弱，導至出現假陰性。此外，類風濕因子、既往感染的殘留和皰疹病毒屬交叉反應均能造成假陽性，因此單一的HCMV-IgM指標對診斷HCMV感染并不可靠。聯合母乳、尿液、單個核細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM檢測有助于患兒HCMV感染的輔助診斷。

綜上所述，若患兒標本不易留取，應優先選擇檢出率高的標本，若條件允許，應同時留取血液、尿液及患兒母親的乳汁，以提高HCMV的檢出率，防止漏診，以便及時給予抗病毒治療，對降低疾病的嚴重性和死亡率至關重要。

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R373.9，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0340-04

謝康，男，1982年生，學士學位，主管技師，醫學檢驗/分子遺傳學專業，主要從事人巨細胞病毒臨床基因擴增檢測、地中海貧血基因檢測及產前診斷、Y染色體微缺失、SRY基因檢測等研究工作。

劉艷秋，女，1964年生，教授，主任醫師，主要從事婦產科、醫學遺傳學、產前診斷等研究工作。E-mail：ragexp@126.com核細胞層于離心管中，12000r/min離心5min，取沉淀。促凝管標本：于3000r/min離心5min，取血清。

2016-09-28；

2017-04-03)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.014