慢性胰腺炎模型胰腺組織彈性模量與病理分級的相關性

王玉濤 張建 潘桂霞 孫高峰 茅娟莉 彭曄 鄭建明 俞文英 汪建華 左長京

·論著·

慢性胰腺炎模型胰腺組織彈性模量與病理分級的相關性

王玉濤 張建 潘桂霞 孫高峰 茅娟莉 彭曄 鄭建明 俞文英 汪建華 左長京

目的 探討慢性胰腺炎(CP)胰腺彈性模量與病理分級的相關性。方法 采用隨機數字表法將21只小型豬分為模型組(18只)和對照組(3只)。采用不全結扎主胰管法建立CP模型，對照組不結扎胰管。術后 4、8、12 周分批處死動物，取胰腺組織行彈性模量檢測及病理檢查，并按照纖維化嚴重程度將小型豬分為對照組及輕、中、重度CP組。觀察胰腺組織實質細胞密度、脂肪浸潤程度、細胞外水腫程度，并進行高低或輕重分級。采用方差分析檢驗不同CP組間彈性模量的差異，采用Spearman等級相關檢驗分析彈性模量與胰腺纖維化的相關性，采用ROC曲線評估其診斷CP的效能。結果 除2只死亡外，模型組16只成功建立不同程度CP模型，其中輕度CP組7只，中度CP組2只，重度CP組7只。對照組胰腺均顯示正常。對照組、輕度CP組和中-重度CP組胰腺彈性模量分別為0.4268±0.0566、0.3203±0.0518、0.2235±0.0685，組間差異有統計學意義(F=13.658，P<0.01)，且彈性模量與病理分級間呈負相關(r=0.969，P<0.01)。彈性模量鑒別正常與輕度CP的AUC為1.000，最佳臨界值為0.3807，診斷敏感性、特異性均為100%；鑒別輕度與中-重度CP的AUC為0.873，最佳臨界值為0.2646，敏感性為85.7%，特異性為77.8%。低實質細胞密度組、高實質細胞密度組的胰腺彈性模量分別為0.1931±0.0373、0.3485±0.0655，高密度組顯著高于低密度組，差異有統計學意義(t=-5.719，P<0.01)；輕度脂肪浸潤組、重度脂肪浸潤組的胰腺彈性模量分別為0.3401±0.0697、0.1855±0.0344，輕度浸潤組顯著高于重度浸潤組，差異有統計學意義(t=5.102，P<0.01)；陰性及輕度細胞外水腫組、中-重度細胞外水腫組的胰腺彈性模量分別為0.2760±0.0825、0.3024±0.1056，組間差異無統計學意義(t=0.586，P>0.05)。結論 彈性模量可以檢測CP病理改變，并能評估CP病理分級。

胰腺炎，慢性； 模型，動物； 彈性模量

Fund program：Science and Technology Development program for Health & Medicine of Zhejiang province(2014KYB238); International Cooperation Foundation of Science and Technology Commission of Shanghai(10410708800); Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY13H070008)

慢性胰腺炎(CP)可導致不可逆的胰腺形態和功能改變[1]，診斷難點在于早期、病變輕微CP的確診。通過常規影像學及胰腺分泌功能檢測診斷早期CP仍存在一定的局限性[2-3]。為此，本研究通過對CP胰腺組織樣本彈性模量與病理嚴重程度相對照，探討彈性模量與CP病理分級的相關性，為臨床上應用彈性模量對CP分級診斷提供組織學參考依據。

材料與方法

一、實驗動物及分組

健康巴馬小型豬 21只，雌雄不限，月齡6～10個月，體重12.5～20.0 kg，由第二軍醫大學實驗動物中心提供，整個實驗過程中對動物的關懷符合倫理學要求。采用隨機數字表法將小型豬分為模型組(18只)及對照組(3只)。模型組動物術前禁食24 h，禁水4 h。采用鹽酸氯胺酮臀部肌內注射誘導麻醉，阿托品肌內注射減少呼吸道分泌物，靜脈輸入枸櫞酸芬太尼及鹽酸氯胺酮聯合3%戊巴比妥維持麻醉。將小型豬仰臥固定于手術臺上，上腹部備皮、消毒、鋪巾后沿腹中線劍突下切口入腹，在十二指腸左緣找到胰腺頭頸部，游離出主胰管。用3.0絲線將主胰管與雙股3.0聚丙烯線一起結扎(聚丙烯線溶解后即為超過75%的主胰管被結扎)，同時結扎胰腺組織，以防止副胰管或側支胰管引流胰液。對照組開腹后僅翻動胰腺及腸道，不結扎胰管。切口無菌包扎后用腹帶固定。分別于造模后4、8、12周處死小型豬，取胰腺組織樣本。

二、彈性模量檢測

應用美國ARTANN實驗室Tissue Elastometer(型號TE-v2.0)彈力檢測儀檢測胰腺組織彈性模量。Tissue Elastometer包括電子天平、線性致動器和筆記本電腦。電子天平作為放置組織樣本的對象板和檢測過程中力測量的裝置，分辨率為0.1 mN，組織樣本最大重量為200 g；線性致動器垂直驅動一個圓柱形壓頭對組織樣本進行壓縮測試，壓頭的直徑為3.0 mm，垂直位移范圍為0～3.2 cm，線性速度為0.05～0.1 mm/s；筆記本電腦內有一個圖形用戶界面和操作軟件。

取胰腺體尾部部分組織，每塊組織塊高度為12～20 mm，長度及寬度為20～40 mm，行3次彈性模量檢測，取均值作為胰腺組織的彈性模量。

三、胰腺組織病理學檢查

剩余的胰腺標本用甲醛固定后常規制作石蠟切片，行HE染色及Van Gieson(VG)染色后，由2名高年資病理科醫師盲法讀片，并按照胰腺纖維化增生程度、腺泡萎縮破壞和炎細胞浸潤程度將CP分為輕、中、重度3級[4]。(1)輕度CP：胰腺腺泡基本正常，輕微纖維化，即纖維化主要分布于小葉周圍，小葉內不受累，可見淋巴細胞、漿細胞和少量巨噬細胞浸潤；(2)中度CP：腺泡萎縮、破壞伴間質纖維化，纖維化增生從小葉周圍擴展到小葉內、腺泡間，間質內可見較多淋巴細胞、漿細胞浸潤；(3)重度CP：小葉周圍和小葉內纖維化相互融合形成較大范圍網格狀纖維化，胰腺腺泡幾乎完全被破壞，間質內仍可見淋巴細胞、漿細胞浸潤，但浸潤的細胞數量較中度減少。此外，觀察胰腺組織實質細胞密度(包括內、外分泌細胞)、脂肪浸潤程度、細胞外水腫程度，并參照文獻[5]進行高低或輕重分級。

四、統計學處理

結 果

一、CP模型制備成功率及分級

剔除病理改變不明顯或術后感染發生死亡的2只外，模型組16只成功建立不同程度CP模型，其中輕度CP 7只，中度CP 2只，重度CP 7只。對照組3只小型豬的胰腺組織未見異常改變。

二、各組小型豬胰腺的彈性模量

對照組及輕、中-重度CP組胰腺的彈性模量分別為0.4268±0.0566、0.3203±0.0518、0.2235±0.0685，組間差異有統計學意義(F=13.658，P<0.01)。胰腺組織彈性模量隨CP病理嚴重程度增加而降低，兩者呈負相關(r=0.969，P<0.01)。對照組與輕度CP組間，輕度CP 組與中-重度CP組間的差異也均有統計學意義(t=2.913，P<0.05；t=3.106，P<0.01)。

三、彈性模量診斷CP的效能

彈性模量鑒別正常與輕度CP的AUC為1.000，最佳臨界值為0.3807，診斷敏感性為100%，特異性為100%，陽性預測值100%，陰性預測值100%，約登指數1；鑒別輕度與中-重度CP的AUC為0.873，最佳臨界值為0.2646，敏感性為85.7%，特異性為77.8%，陽性預測值87.5%，陰性預測值75.0%，約登指數0.635(圖1)。

圖1 彈性模量鑒別輕度CP與中-重度CP的ROC曲線

四、其他觀察指標

7只小型豬胰腺為低實質細胞密度，12只胰腺為高實質細胞密度，它們的胰腺彈性模量分別為0.1931±0.0373、0.3485±0.0655，高密度組顯著高于低密度組，差異有統計學意義(t=-5.719，P<0.01)；13只小型豬胰腺輕度脂肪浸潤，6只胰腺重度脂肪浸潤，它們的胰腺彈性模量分別為0.3401±0.0697、0.1855±0.0344，輕度浸潤組顯著高于重度浸潤組，差異有統計學意義(t=5.102，P<0.01)；8只小型豬胰腺陰性或輕度細胞外水腫，11只胰腺中-重度細胞外水腫，它們的胰腺彈性模量分別為0.2760±0.0825、0.3024±0.1056，中-重度水腫組略高于陰性或輕度水腫組，差異無統計學意義(t=-0.586，P=0.566)。

討 論

病理學診斷是CP診斷的確定標準，但臨床工作中不易獲得早期CP(或稱為疑似CP)患者的胰腺樣本。CP診治指南[1]不推薦常規使用胰腺活組織檢查，且該檢查受技術條件限制，很難反應CP組織的整體狀況，有一定并發癥的風險[6]。小型豬阻塞性CP的發病機制、理化指標、大體形態及影像學表現均與人類十分相近[4,7-8]。因此，應用小型豬CP模型作為研究平臺可彌補臨床研究的限制和不足。

胰腺實質纖維化是CP典型的病理組織學特征之一[8]，是一種主動進行的病理損害過程，可導致胰腺實質硬度增加。生物組織的彈性或者硬度在很大程度上依賴于組織分子以及這些分子結構在微觀、宏觀上的組織形式。彈性模量是物體彈性變形程度的表征，宏觀上是衡量物體抵抗彈性變形能力大小的尺度，微觀上則是原子、離子或分子之間鍵合強度的反映[9]。組織的彈性模量變化與異常的病理狀態相關，不同的組織以及同一組織的不同病理狀態之間彈性或硬度存在差異。

本研究結果顯示，正常組、輕度CP組與中-重度CP組間彈性模量差異均有統計學意義，且隨著CP胰腺組織纖維化程度加重而下降，呈負相關。應用彈性模量鑒別輕度CP與正常胰腺的敏感性、特異性均達100%，鑒別輕度與中-重度CP的敏感高達85.7%，特異性高達77.8%，表明彈性模量不僅可以用于早期發現CP，并且有助于判斷CP 纖維化的嚴重程度。

本研究結果還顯示，輕度脂肪浸潤組和重度脂肪浸潤組、低實質細胞密度組和高實質細胞密度組間彈性模量差異均有統計學意義；陰性或輕度細胞外水腫組、中-重度細胞外水腫組間彈性模量的差異無統計學意義，提示胰腺組織彈性模量與脂肪浸潤程度、實質細胞密度相關，而與細胞外水腫程度無明顯相關性。Sugimoto等[10]的研究結果顯示，彈性模量與胰腺脂肪比例無相關性。纖維化、脂肪浸潤、細胞密度和水腫均認為是影響胰腺組織彈性的組織學因素。纖維化對胰腺組織彈性模量的影響明顯高于脂肪浸潤，也可能掩蓋了脂肪浸潤引起的彈性變化[5]。此外，研究結果的差異也可能與抽樣誤差有關。

由于條件所限，本研究的標本量較少，另外活體和體外實驗是否存在差異、胰腺不同狀態下的結果是否存在差異等，都需要進一步深入研究。

[1] 中華醫學會外科學分會胰腺外科學組. 慢性胰腺炎診治指南(2014版)[J]. 中華外科雜志, 2015, 53(4): 241-246. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0529-5815.2015.04.001.

[2] Perez-Johnston R, Sainani NI, Sahani DV. Imaging of chronic pancreatitis (including groove and autoimmune pancreatitis)[J]. Radiol Clin North Am, 2012, 50(3): 447-466. DOI: 10.1016/j.rcl.2012.03.005.

[3] N?jgaard C, Olesen SS, Fr?kjaer JB, et al. Update of exocrine functional diagnostics in chronic pancreatitis[J]. Clin Physiol Funct Imaging, 2013, 33(3): 167-172. DOI: 10.1111/cpf.12011.

[4] 汪建華, 張建, 孫高峰, 等. 慢性胰腺炎模型胰泌素刺激動態MR胰膽管成像表現及與病理程度分級的相關性[J]. 中華放射學雜志, 2015, 49(9): 698-703. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1005-1201.2015.09.013.

[5] Itoh Y, Itoh A, Kawashima H, et al. Quantitative analysis of diagnosing pancreatic fibrosis using EUS-elastography (comparison with surgical specimens)[J]. J Gastroenterol. 2014, 49(7): 1183-1192. DOI: 10.1007/s00535-013-0880-4.

[6] Teoh AY, Tang RS. Clinical evaluation of new diagnostic modalities of endoscopic ultrasound for pancreaticobiliary diseases[J]. Dig Endosc, 2015, 27 Suppl 1:55-59. DOI: 10.1111/den.12444.

[7] 汪建華, 張建, 孫高峰, 等. 小型豬不同程度阻塞性慢性胰腺炎模型建立及其CT表現[J]. 中華胰腺病雜志, 2012, 12 (6): 403-405. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.06.013.

[8] Sun G, Wang J, Zhang J, et al. High-resolution magic angle spinning (1)H magnetic resonance spectroscopy detects choline as a biomarker in a swine obstructive chronic pancreatitis model at an early stage[J]. Mol Biosyst, 2014, 10(3): 467-474. DOI: 10.1039/c3mb70406h.

[9] 邊薔, 胡海威, 溫建民, 等. 足部相關肌肉、肌腱組織材料彈性模量的測定[J]. 中國組織工程研究, 2015, 19(12): 1919-1923. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.12.022.

[10] Sugimoto M, Takahashi S, Kojima M, et al. What is the nature of pancreatic consistency? Assessment of the elastic modulus of the pancreas and comparison with tactile sensation, histology, and occurrence of postoperative pancreatic fistula after pancreaticoduodenectomy[J]. Surgery, 2014, 156(5): 1204-1211. DOI: 10.1016/j.surg.2014.05.015 .

(本文編輯：屠振興)

Correlation of tissue elasticity modulus and pathological grades in a chronic pancreatitis model

WangYutao,ZhangJian,PanGuixia,SunGaofeng,MaoJuanli,PengYe,ZhengJianming,YuWenying,WangJianhua,ZuoChangjing.

DepartmentofRadiology,AffiliatedHospital,MedicalSchool,NingboUniversity,Ningbo315020,China

WangJianhua,Email:woxingw@sina.com;ZuoChangjing,Email:changjing.zuo@qq.com

Objective To investigate the correlativity between elasticity modulus and pathological severity in chronic pancreatitis (CP). Methods Twenty-one pigs were divided randomly into experimental group (n=18) and control group (n=3) using random number method. The main pancreatic duct (MPD) was incompletely ligated to establish the CP model. In control group, MPD was not ligated. The animals were killed in batches at 4th, 8th and 12th week after surgery. The pancreatic tissue was taken for elasticity modulus test and pathological examination, and the pigs were classified into control, mild, moderate and severe groups based on the severity of fibrosis. Cell density, fat infiltration and extracellular edema were observed and classified into mild and severe. The difference of elasticity modulus among different groups were compared by Variance analysis, the correlation between pancreatic fibrosis and elastic modulus was analyzed with Spearman correlation analysis, and ROC curve was used to evaluate its efficacy of diagnosing CP.Results Sixteen CP models were established successfully expected for 2 deaths (mild,n=7; moderate,n=2 and severe,n=7). All of the control group (n=3) showed normal pancreas. The elasticity modulus of control, mild and moderate to severe group were 0.4268±0.0566, 0.3203±0.0518 and 0.2235±0.0685, respectively. The difference between the groups was statistically significant (F=13.658,P<0.01), and the elastic modulus and pathological grade had a negative correlation (r=0.969,P<0.01). AUC of elasticity modulus for differentiating normal and mild CP was 1.000, the best critical value was 0.3807, and both the sensitivity and specificity of the diagnosis were 100%. AUC for differentiating mild and moderate to severe CP was 0.8730, the best critical value was 0.2646, and the sensitivity and specificity of the diagnosis were 85.7% and 77.8%, respectively. The pancreatic elasticity modulus of low parenchymal cell density group and high parenchymal cell density group were 0.1931±0.0373 and 0.3485±0.0655, respectively, which in the high cell density group was significantly higher than that in the low cell density group (t=-5.719,P<0.01). The elasticity modulus of negative infiltration or slight fatty infiltration group and severe fatty infiltration group were 0.3401±0.0697 and 0.1855±0.0344, respectively, which in the negative infiltration or slight infiltration group was significantly higher than that in severe infiltration group (t=5.102,P<0.01). The elasticity modulus of negative or mild cell edema group and moderate to severe cell edema group were 0.2760±0.0825 and 0.3024±0.1056, respectively; there was no statistically significant(t=-0.586,P>0.05). Conclusions The elasticity modulus can be used to detect the pathological changes of CP, and evaluate the CP pathologic grades.

Pancreatitis，chronic； Models，animal； Elasticity modulus

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.03.002

315020 寧波，寧波大學醫學院附屬醫院影像科(王玉濤、汪建華)；第二軍醫大學長海醫院核醫學科(張建、潘桂霞、孫高峰、茅娟莉、彭曄、左長京)，長海醫院病理科(鄭建明)；寧波市臨床病理診斷中心病理一科(俞文英)

共同第一作者：張建

汪建華，Email: woxingw@sina.com；左長京，Email: changjing.zuo@qq.com

浙江省醫藥衛生科技計劃項目(2014KYB238)；上海市國際科技合作基金(10410708800)；浙江省自然科學基金(LY13H070008)

2017-01-12)