四川自貢地區健康人群中艾伯特埃希菌的分離鑒定

張 玲，劉 祥，許彥梅，李新瓊，王 紅，熊衍文

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四川自貢地區健康人群中艾伯特埃希菌的分離鑒定

張 玲1，劉 祥1，許彥梅2，李新瓊1，王 紅1，熊衍文2

目的 了解長期從事雞鴨等家禽養殖及屠宰人員等健康人群艾伯特埃希菌的攜帶情況。方法 收集家禽養殖、屠宰人群及其他健康人糞便，經EC肉湯增菌后PCR檢測eae基因，陽性樣品接種麥康凱瓊脂，挑選不發酵乳糖菌落，通過16S rDNA序列分析和多位點序列分型(MLST)對菌株進行鑒定。分離株進行緊密粘附素亞型和cdtB亞型分析，并通過脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析與動物來源艾伯特埃希菌菌株間的相關性。結果 從189份從事雞鴨宰殺人員的糞便中，分離到2株艾伯特埃希菌，從58份其他健康人群糞便中分離到1株菌，而138份家禽養殖場人員糞便中未分離到菌株。3株菌株的緊密粘附素亞型分別為sigma, iota 2, nu，cdtB亞型均為 II/III/V亞型。PFGE顯示三株菌之間的帶型相似性小于80%，并且與雞鴨等來源的艾伯特埃希菌帶型不同。結論 從事雞鴨屠宰等健康人員中存在一定程度的艾伯特埃希菌攜帶率，但其與家禽攜帶艾伯特埃希菌的關系，仍需進一步研究。

艾伯特埃希菌；健康人群；eae；MLST；PFGE

艾伯特埃希菌是2003年命名的埃希菌屬中的一個新種，作為一種腸道病原菌，可引起人感染性腹瀉。1991年Albert等首次從孟加拉達卡腹瀉兒童糞便標本中分離到艾伯特埃希菌[1]。由于艾伯特埃希菌缺乏區分其他腸道致病菌，尤其是區分大腸埃希菌的特異性生化特征，傳統的商品化生化鑒定系統往往將艾伯特埃希菌鑒定為魯氏耶爾森菌，沙門氏菌，蜂窩哈夫尼亞菌，或大腸埃希菌等，使實驗室對其鑒定存在相對困難，往往被誤檢為同樣攜帶eae基因的EPEC/EHEC。目前主要采用多位點序列分型(MLST)，16srDNA測序等分子生物學方法，構建系統進化樹進行聚類分析[2]。Ooka等[2]對278株eae陽性鑒定為大腸埃希菌的菌株進一步通過多位點序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)等分析，從中鑒定出26株為艾伯特埃希菌，其中14株來自人，11株來自鳥類，1株來自貓科動物，14份來自人的菌株中，有13份是分離自胃腸道感染患者。近年來日本出現多起由艾伯特埃希菌引起的食物中毒報道[3-5]。2004年美國阿拉斯加出現的一起大規模金翅鳥雀死亡也與艾伯特埃希菌有關[6]，近期韓國的一項調查表明，多種鳥類可攜帶艾伯特埃希菌[7]。

目前國內對艾伯特埃希菌引起人類感染導致腹瀉疾病的相關研究未見報道。我們前期從四川自貢地區市售生豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉中分離到艾伯特埃希菌，特別是雞腸和鴨腸的檢出率更高[8]。本研究旨在對中國四川省自貢市農貿市場中長期從事雞鴨宰殺工作和養殖場中從事雞、鴨及鵪鶉養殖的人群是否攜帶艾伯特埃希菌進行調查，并同時從市場中采用單純隨機抽樣的方式抽取一部分工作地點遠離雞鴨宰殺攤位，從事與生鮮食品產銷無關的人群作為對照，以探討雞鴨等攜帶艾伯特埃希菌對相關人群健康的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2015年6-7月，收集四川省自貢地區從事雞、鴨、鵪鶉養殖場養殖人員糞便138份、農貿市場中雞鴨屠宰人員糞便189份，并收集遠離雞鴨宰殺攤位，從事與生鮮食品產銷無關的對照人群糞便58份。上述人員近期(2周內)均無腹瀉病史。樣品具體信息如表1所示。糞便樣品置30%甘油的腦心肉湯保存管中，低溫運送到自貢市疾病預防控中心實驗室進行細菌分離培養。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 恒溫恒濕生化培養箱(黃石恒豐)、電熱恒溫培養箱(上海一恒)、SensoQuest Labcycler PCR儀(德國SensoQuest)、GEL DocXR+凝膠成像系統(美國Bio-Rad )。

1.2.2 主要試劑 EC肉湯、木糖、乳糖購于北京陸橋技術股份有限公司；Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs 及DNA Marker：購于寶生物工程(大連)有限公司；2×Taq MasterMIX(含染料)和DNA Marker(DM1000)：購自康為世紀生物科技有限公司；核酸染料(GeneGreen)：購自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物合成及測序：由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.3 艾伯特埃希菌篩查 取1 mL左右糞便保存液于5 mL EC肉湯中，20 ℃震蕩培養24—36 h。取1 mL增菌液至1.5 mL無菌離心管中，8 000 r/min離心8 min，棄上清，以100 μL去離子水重懸后，水煮10 min，10 000 r/min離心3 min，上清液作即為PCR檢測模板，檢測eae基因[3]。將eae基因檢測陽性的EC增菌液，接種麥康凱瓊脂，36 ℃培養過夜，挑選無色圓形光滑菌落，PCR檢測eae基因。eae陽性菌落傳代到營養瓊脂培養基，過夜培養。菌株純培養后進行乳糖、木糖發酵和動力試驗。

1.4 艾伯特埃希菌菌株鑒定 將eae陽性、不發酵乳糖、不發酵木糖及無動力菌株，進行16S rDNA序列分析，即以上游引物16S-F(5′-agagtttgatcmtggctcag-3′)和下游引物16S-R (5′-tacggytaccttgttacgactt-3′)PCR擴增疑似菌株，擴增產物測序后進行序列比對和聚類分析[9]。根據大腸埃希菌大腸埃希菌MLST數據庫(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli)提供的7個管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)，對艾伯特埃希菌疑似菌株進行MLST分析。MLST參考菌株的選擇、進化樹構建按照文獻進行[10]。

1.5 艾伯特埃希菌分子特征分析 緊密粘附素分型分析及cdtB基因檢測和分型分析，參見文獻[8]。參照PulseNet非O157大腸埃希菌PFGE分型方案，對3株艾伯特埃希菌進行PFGE分型分析，并使用BioNumerics 4.0軟件對健康人群分離菌株及動物來源分離株構建UPGMA聚類樹。

2 結 果

2.1 樣品初篩結果 從189份從事雞鴨宰殺人員的糞便中，分離到2株eae基因陽性不發酵乳糖和木糖、動力陰性的疑似菌株，檢出率為1.06%；從138份家禽養殖場人員糞便中未分離到疑似菌株。從58份對照人群糞便中分離到eae基因陽性1份不發酵乳糖和木糖、動力陰性的疑似菌株，檢出率為1.72%。家禽屠宰、養殖人群和其他健康人群艾伯特埃希菌疑似菌株篩查情況見表1。

表1 家禽屠宰、養殖人群和其他健康人群艾伯特埃希菌疑似菌株篩查情況
Tab.1 The situation of screening suspectedEscherichiaalbertiifor poultry slaughter population, poultry farming population and other healthy population

健康人群Healthypopulation初篩陽性率%Screeningpositiverate%家禽屠宰人群Poultryslaughterpopulation1.06(2/189)家禽養殖人群Poultrybreedingpopulation0(0/138)其他健康人群Otherhealthypopulation1.72(1/58)合計Total0.78(3/385)

2.2 疑似菌株的鑒定

2.1.1 16S rDNA序列分析 16S rDNA序列分析基因測序長度為1 506 bp，去掉兩端測序無效的序列，最后獲得1 404 bp長度序列用于分析。系統進化樹表明此次分離的3株菌株與艾伯特埃希菌參考菌株LMG 20976、KF1、NBRC107761、TW07627等相似性最大，而與大腸埃希菌、弗格森埃希菌等參考菌株差異較大，支持這3株疑似菌株均為艾伯特埃希菌。

2.1.2 多位點序列分析(MLST) 按照大腸埃希菌MLST數據庫提供的分型方案，獲得7個管家基因的序列，并將這7個基因的序列拼接后獲得3 423 bp長度的序列，以大腸埃希菌K-12 MG1655的序列為參考與艾伯特埃希菌參考菌株LMG 20976、KF1菌株序列構建Neighbor-Joining樹，見圖1。MLST分析表明，3株疑似菌株中有2株序列完全一致，與另一株存在較小的差異，這3株分離株均與艾伯特埃希菌親緣關系最近。根據16S rDNA序列分析和MLST分析結果，可以確定這3株疑似菌株菌為艾伯特埃希菌。

圖1 3株艾伯特埃希菌與參考菌株基于7個管家基因序列的Neighbor-Joining樹Fig.1 Neighbour-joining dendrogram of three E.albertii strains and reference strains based on the seven housekeeping genes

2.3 菌株分子生物學特征

2.3.1 緊密粘附素亞型及cdtB分型結果 根據緊密粘附素全長序列的聚類分析結果，從雞鴨宰殺人群糞便中分離的TS20150072菌株是Sigma亞型，TS20150248菌株是iota 2亞型，而對照人群糞便中分離的TS20150298菌株屬于nu亞型。3株分離株cdtB亞型均為II/III/V亞型群，見圖2。

2.3.2 PFGE分型結果 3株健康人群的艾伯特埃希菌均產生了較清晰的條帶，并且3株菌之間的PFGE帶型均不相同。通過與數據庫中來自雞腸、鴨腸、雞肉、鴨肉、豬肉、羊肉及白鷺糞便中分離的48株艾伯特埃希菌PFGE帶型聚類比較分析，發現這3株健康人群菌株的帶型與動物源性菌株的PFGE帶型存在差異，且聚類相似性均小于80%，見圖2。

3 討 論

艾伯特埃希菌作為一種非常重要的潛在新發食源性致病菌，它可以引起人類胃腸道疾病，如腹瀉、腹脹、發熱、脫水、嘔吐等，與多起食源性疾病爆發有關[11-12]。日本有多起報道從腸胃炎的患者中分離鑒定出艾伯特埃希菌[13-14]，美國明尼蘇達州和伊利諾斯州的腹瀉患者、幾內亞比紹兒童也分離到該菌[6、15-16]。Inglis TJ 等在患有胃腸道感染的76歲菌血癥患者的血液、糞便中檢出艾伯特埃希菌，是第一例艾伯特埃希菌腸外感染病例[17]。

艾伯特埃希菌是一種引起人畜共患病的病原體，因此在家禽家畜，野生動物，鳥類等動物宿主也有報道檢出。中國四川地區從野生白鷺分離到1株，從雞腸、鴨腸中分離到37株艾伯特埃希菌[8],Ooka等從1株來自貓科動物樣本中鑒定出1株艾伯特埃希菌[2]，此外，在北美、歐洲、澳大利亞的各種野生和家養鳥類中也檢出了艾伯特埃希菌[6]。在各種食品和飲用水中也有艾伯特埃希菌感染的報道。中國四川地區從雞肉、羊肉、豬肉、鴨肉分離到7株艾伯特埃希菌[8]，在在美國的雞漂洗液中也檢出艾伯特埃希菌[18]。在匈牙利醫院的飲用水分配系統中也有檢出[19]。

圖2 3株健康人群艾伯特埃希菌分離株與48株動物源性艾伯特埃希菌菌株的PFGE帶型聚類圖Fig.2 Dendrogram of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) profiles of E.albertii between 3 strains from people stool and 48 strains from animal derived food

本項目在雞腸、鴨腸、雞肉、鴨肉檢出較多艾伯特埃希菌，那么長期從事雞鴨養殖、宰殺等的人群危險性是否高于一般的人群，這種危險性是否造成艾伯特埃希菌感染的流行都需要加以關注。本次研究為主動監測，從189份從事雞鴨宰殺人員的糞便中，分離到2株艾伯特埃希菌，從58份其他健康人群糞便中分離到1株菌，而138份家禽養殖場人員糞便中未分離到菌株，說明健康人群中確實攜帶該菌。國外暫時未見對密切接觸人群艾伯特埃希菌感染情況調查的報道。

通過PFGE帶型的對比分析，此次分離的3株菌株與雞腸、鴨腸、雞肉、鴨肉、牛肉、白鷺等樣品中分離的菌株的帶型存在差異，暫時未發現兩者之間的遺傳學聯系。但是此次實驗說明從事雞鴨宰殺的人群確實能檢出艾伯特埃希菌，也就是說這類人群是可能成為病原體的傳染源。

目前國內外都缺乏艾伯特埃希菌商品化生化鑒定系統，限制了在食物中艾伯特埃希菌的發病率調查。我國作為食源性腹瀉多發國家之一，艾伯特埃希菌很可能是導致腹瀉疾病的病原體，因此在我國系統的開展對該菌的檢測，研究致病機制，確定危險因素，對有效控制該菌的感染和暴發至關重要。下一步可以通過增加樣本量來提高檢出率，通過多元統計分析確定艾伯特埃希菌感染的高危因素。通過建立該病原體檢測的技術儲備，結合分子生物學研究，對艾伯特埃希菌早期發現、早期診斷、有效控制，進而保護人群健康具有重要的公共衛生學意義[20]。

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Identification ofEscherichiaalbertiifrom healthy carriers in Zigong,Sichuan Province, China

ZHANG Ling1, LIU Xiang1,XU Yan-mei2, LI Xin-qiong2,WANG Hong1, XIONG Yan-wen2

(1.ZigongCenterforDiseaseControlandPrevention,Zigong643000,China；2.StateKeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

We investigated the carrying situation ofEscherichiaalbertiifrom healthy people engaged in breeding and slaughtering poultry for a long time. We collected stool samples from people engaged in breeding and slaughtering poultry and other healthy people. After enriched with EC broth,eae-positive enrichment culture was directly streaked on MacConkey, andeae-positive lactose non-fermenting isolate was retained for further investigation. The 16S rDNA sequencing and multilocus sequence typing (MLST) were applied in the identification ofE.albertiifrom suspected strains. Intimin subtypes andcdtBtypes ofE.albertiistrains were detected. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was used to detected genetic polymorphism of strains from this study and animal source ones. Results showed that two isolates were identified asE.albertiifrom 189 stools of people exposed to slaughtering chickens and ducks and one from 58 stools in control groups. No isolate was identified asE.albertiifrom 138 stools samples of people exposed to breeding poultry. Intimin subtypes of three isolates from stool samples were subtyped as sigma, iota 2, nu, andcdtBtypes were closely related to types II/III/V. PFGE patterns of the three strains was distinguishable (<80% similarity), and appeared in different cluster with chickens, ducks and other sources ofE.albertiistrains. The rate of carryingE.albertiito a certain extent exist in healthy people engaged in slaughtering chickens and ducks, and the relationship between these strains and strains from poultry should be further investigated.

Escherichiaalbertii; healthy carriers; eae; MLST; PFGE

s:Wang Hong, Email: 460973389@qq.com；Xiong Yan-wen, Email: xiongyanwen@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.019

自貢市重點科技計劃項目(No.2013S06)，四川省衛生和計劃生育委員會科研課題(No.150259),傳染病預防控制國家重點實驗室開放課題(No.2016SKLID309)聯合資助

王 紅，Email: 460973389@qq.com； 熊衍文，Email: xiongyanwen@icdc.cn

1.自貢市疾病預防控制中心，自貢 643000； 2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206

R378

A

1002-2694(2017)06-0569-05

2016-09-01 編輯：梁小潔

Supported by the Zigong Key Science and Technology Program(No.2013S06),the Health and Family Planning Commission of Sichuan Province(No.150259)and the Open Project from State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control(No.2016SKLID309)