超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜測定蜂蜜中甲硝唑殘留

馬曉年++李文廷++歐利華++梁志堅+++段海波

甲硝唑具有廣譜抗厭氧菌和抗原蟲的作用，主要用于預防和治療厭氧菌引起的感染。蜂蜜營養豐富，是人類重要的滋補食品，由于諸多原因，蜂蜜中可能存在甲硝唑的殘留，給消費者帶來潛在的危害。

目前，國內外采用的檢測甲硝唑殘留的方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、氣質聯用和液質聯用。本方法采用超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜法對蜂蜜中的甲硝唑殘留進行測定，取得滿意結果。

實驗部分

試劑與儀器。液相色譜-串聯質譜儀，配電噴霧離子源和大氣壓化學源（美國AB公司）；BEH C18柱（Waters公司）；實驗用水為二次蒸餾水；甲醇、乙腈、乙酸乙酯為色譜純，濃氨水、濃鹽酸為分析純；甲硝唑標準物質（Dr.Ehrenstorfer）；甲硝唑-D4同位素內標（Dr.Ehrenstorfer）；蜂蜜（超市）。

分析條件。色譜柱：Waters BEH C18柱（1.7?m，2.1mm×100mm）；流動相：0.05%氨水：乙腈梯度洗脫；流速0.4mL/min；進樣量：20?L。掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測（MRM）；離子化電壓：5500V；噴霧器壓力：40psi；氣簾氣壓力：35psi；輔助氣流速：40?L/min；離子源溫度：450℃；去簇電壓（DP）：52V。

樣品處理。（1）樣品提取。稱取蜂蜜5.00g于50mL離心管中，分別加入100?L 20ng/mL D4-甲硝唑應用液，加水10mL，混勻溶解，再加入10 mL乙酸乙酯，渦旋提取2min，1000rpm離心2min，吸取上層乙酸乙酯相5mL入10mL試管，50℃氮氣吹干后，加入0.1mL甲醇溶解，再加入1.9mL 40mmol/L鹽酸溶液，超聲溶解1min，轉入2mL離心管，12000rpm離心2min，上清液待凈化。

（2）樣品凈化。依次用5mL甲醇、5mL水、5mL 40mmol/L鹽酸溶液活化平衡MCS固相萃取柱，然后轉移上述上清液至MCS柱內，待樣品過柱后，用5mL水淋洗除去雜質，再用5mL甲醇淋洗除雜質，真空抽干后用5mL 5%氨化甲醇洗脫，收集于10mL具塞試管內，得洗脫液；洗脫液在50℃下用氮氣吹干，先加入0.1mL甲醇超聲溶解殘留物，再加入0.9mL 10%甲醇/水溶液混勻，過0.22?m濾膜后待LC-MS/MS分析。

結果與討論

質譜條件的選擇。在流動注射狀態下將甲硝唑和D4-甲硝唑的標準溶液注入離子源中，在正離子和負離子的檢測方式下進行母離子全掃描，并確定母離子質量數，結果表明甲硝唑在正離子模式下產生最強峰。以目標化合物的準分子離子峰為母離子，進行二級質譜掃描，最后采集全掃描的二級質譜圖，得到碎片離子信息，然后再對得到的目標化合物的二級質譜參數進行優化，使得子離子在保證分辨率的條件下靈敏度最佳。

色譜條件優化。為了有利于色譜峰的分離，消除樣品雜質對目標物的干擾，本方法采用乙腈-0.05%的氨水溶液為流動相，利用梯度洗脫的方法提高分離和檢測效果。檢測開始時，流動相中乙腈-0.05%的氨水的體積比為10：90，并保持0.5min；0.5～2.0min，乙腈的比例由10%線性上升至90%，保持此比例1min，這部分主要是因為乙腈在流動相中所占比例，決定甲硝唑的保留時間、峰形和測定的靈敏度；3.0～3.5min， 乙腈的比例由90%線性下降至10%，并保持1.5min。實驗表明，在此梯度條件下，甲硝唑與雜質達到完全分離。

樣品提取溶劑的選擇。甲硝唑易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑。有研究選用乙酸乙酯作為提取溶劑，乙酸乙酯提取雜質多，提取顏色較深，但乙酸乙酯提取率高，因此本實驗選用乙酸乙酯提取樣品中的甲硝唑，氮氣吹干。

方法的線性關系。將甲硝唑和D4-甲硝唑制備成含甲硝唑0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0ng/mL，含D4-甲硝唑2.0ng/mL的混合標準溶液直接進樣。以含量對峰面積的比值繪制標準曲線。結果見表1。

回收率及精密度實驗。準確稱取空白樣品9份，每份5.00g，共3組，分別在蜂蜜空白樣品中添加0.5、2.0、5.0ng甲硝唑， D4-甲硝唑含量與標準曲線相同。按供試品溶液制備方法制備后進行測定，結果見表2。結果可見，不同濃度平均加標回收率88%～94.3%，平均相對標準偏差為5.5%～7.6%。圖2為加標樣品中MRM色譜圖。

應用本方法檢測了5個地州不同產地蜂蜜共36件，甲硝唑檢出35件，檢出率高達97.22%。實驗結果表明，在蜂蜜中甲硝唑的濫用問題非常嚴重，應引起足夠的關注，加大監管力度。本方法具有很高的選擇性和靈敏度，容易操作，適用于日常檢驗，可為甲硝唑污染監測工作提供依據。