基于QuEChERS法提取液相色譜-串聯質譜法測定新會陳皮中的9 種真菌毒素和農藥殘留

彭曉俊,曾麗珠,伍長春,梁偉華

(1.新會出入境檢驗檢疫局,廣東 江門 529100;2.陽江出入境檢驗檢疫局,廣東 陽江 529500)

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基于QuEChERS法提取液相色譜-串聯質譜法測定新會陳皮中的9 種真菌毒素和農藥殘留

彭曉俊1*,曾麗珠2,伍長春1,梁偉華1

(1.新會出入境檢驗檢疫局,廣東 江門 529100;2.陽江出入境檢驗檢疫局,廣東 陽江 529500)

建立了QuEChERS-改性多壁碳納米管提取凈化結合液相色譜-質譜聯用同時檢測新會陳皮中6 種真菌毒素和3 種農藥殘留的分析方法，并對影響提取、凈化、檢測效率的因素進行了優化。以乙腈-水(80∶20)提取樣品，適量改性多壁碳納米管凈化后，凈化液直接用HPLC-MS/MS進行測定，選擇多反應監測模式，基質匹配標準溶液外標法定量。在優化實驗條件下，9 種目標化合物在各自線性范圍內均具有良好的線性關系，相關系數為0.983 8～0.998 2，檢出限(S/N=3)為0.18～10 μg/kg。在低、中、高3個加標水平的平均回收率為72.4%～106%，相對標準偏差為2.2%～7.4%。該法準確、靈敏度高﹑操作簡單﹑快速，可滿足新會陳皮中上述9 種化合物同時測定的要求，應用于真菌毒素和農藥殘留的快速篩查和確證，結果滿意。

QuEChERS；改性多壁碳納米管；液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)；真菌毒素；農藥殘留；新會陳皮

陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，新會是陳皮的道地產區，新會陳皮為廣東十大地道中藥材之一，是“廣東三寶”(陳皮、老姜、禾稈草)的第一寶和清廷貢品，而經年陳藏的新會陳皮更是珍品。2016 年新會陳皮種植面積共6.5 萬畝，陳皮總產量預計達7 000 噸，行業產值近30 億元，但新會陳皮面臨的食品安全風險十分嚴峻。陳皮在加工儲存過程中，由于受溫度濕度等影響，容易霉變而產生真菌，真菌代謝產生有毒的真菌毒素，真菌毒素能損壞人的肝腎功能、致癌、致畸并誘發免疫抑制性疾病[1]。在這些代謝物中，黃曲霉毒素類、赭曲霉毒素類、玉米赤霉烯酮對人體健康危害尤為巨大。農作物種植過程中引入的農藥殘留，通過食物鏈進入人體，進而危害人類健康，同樣是導致食品安全突發事件頻發的主要原因。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是應用最為廣泛的除草劑，滅多威是一種廣譜性氨基甲酸酯類殺蟲劑，毒死蜱則是最常用的殺蟲劑，這3 種農藥高效、廣譜，具有擊倒速度快、作用范圍廣等特點，在我國使用廣泛[2]。因此，由真菌毒素、農藥殘留產生的健康風險問題日益受到人們的關注。

目前，真菌毒素的檢測方法主要有酶聯免疫法(ELISA)[3-5]、薄層色譜法[6]、液相色譜法[7-9]和液質聯用法[10-14]等，但前3種方法的選擇性較差，只能檢測單一種類的真菌毒素。農藥的定量檢測一般采用氣相色譜法[15-16]、氣質聯用法[17-18]。現有的真菌毒素、農藥殘留檢測方法相對較為獨立，真菌毒素和農藥殘留不能同時檢測，無法滿足食品安全突發事件檢測時間短、檢測目標組分多的快速處置要求。近年來，液質聯用技術(HPLC-MS/MS)在檢測方面的優勢逐漸顯現，采用選擇離子監測技術，可大大提高檢測的靈敏度和準確性，已被越來越多地應用于高通量分析，但常規前處理方法步驟繁瑣、有機試劑消耗量大，對操作人員技能要求高。新會陳皮含有揮發油、黃酮化合物、有機酸等化學成分，還有大量色素、脂肪、糖等生化成分，用傳統的液液萃取、索氏抽提、固相萃取等前處理方法，普遍存在基質干擾嚴重、步驟繁瑣、重現性差且有機溶劑消耗量大等缺點。2003年，Anastassiades等[19]建立了QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)新型樣品前處理方法，QuEChERS可以根據樣品基質和待測物的特性，選擇合適的有機提取溶劑和凈化填料，具有快捷、簡便、高效、環保等優點。QuEChERS前處理方法結合液質聯用測定陳皮中真菌毒素、農藥殘留的方法尚未見報道。1991 年，日本電鏡專家Iijima[20]發現了多壁碳納米管(MWNTs)，但未處理的MWNTs表面缺少官能基團，疏水性強、不溶不熔、易纏結團聚，影響了其作為吸附劑應用。本文通過對MWNTs進行衍生化化學修飾，用強氧化性酸對MWNTs進行酸處理，使其表面產生一定量的羥基、羧基等含氧活性官能基團，有效提高了改性MWNTs在溶液介質中的分散性能和對有機化合物的吸附性能，加之改性MWNTs準一維的中空管結構和高的比表面積，因此在吸附方面具有優異的性能。本研究利用改性MWNTs在吸附方面具有的優異性能去除樣品中的干擾，采用QuEChERS提取、改性MWNTs凈化、液質聯用測定，建立了新會陳皮中6 種真菌毒素和3 種農藥殘留的快速、準確、簡便分析方法。相關研究能夠為樣品的快速篩查提供可靠的技術支持，將其應用于新會陳皮食品安全突發事件的快速應急處置工作，可整體提升應急處置工作效率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT 高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；API 3200質譜儀(美國ABsciex公司)；H-800-1 型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；Nexus 670 型傅立葉變換紅外光譜掃描儀(美國Thermo公司)；2-16 型通用臺式高速離心機(德國Sigma公司)；DZF-6050 型真空干燥機(上海精密儀表公司)；KQ 2200DB 型超聲振蕩器(昆山超聲儀器有限公司)；LAB DANCER 渦旋混合器(德國IKA公司)；DN-12W 氮吹儀(上海比郎公司)；Milli-Q 超純水系統(美國Millipore公司)；50 mm×0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜(美國Millipore公司)。

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、滅多威(Methomyl)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)標準品均購自美國Sigma公司；甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；甲酸、乙酸銨(優級純，上海安譜公司)；MWNTs填料(純度>95%，直徑10～20 nm，長度300～800 nm，深圳納米港有限公司)；Florisil填料(80～100 目，上海博勢公司)；PSA填料(平均粒度45 μm，孔體積0.8 m3/g，山東奧秘公司)；硅膠(60～100目，青島海洋化工)；實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Shimadzu C18(150 mm×2.1 mm×3.5 μm)；流速：0.20 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A為5 mmol/L 乙酸銨水溶液(含1%甲酸)，B 為乙腈；梯度洗脫程序：0～2 min，10%B；2～20 min，10%～80%B；20～26 min，10%B。

1.2.2 質譜分析條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；碰撞氣壓力：60 kPa；氣簾氣壓力：250 kPa；霧化氣壓力：550 kPa；加熱輔助氣壓力：550 kPa；MRM參數見表1。

表1 9種化合物的串聯質譜檢測參數

*quantitative ion

1.3 MWNTs改性

稱取50 g MWNTs置于500 mL燒瓶中，加入50 mL濃硫酸，超聲30 min，再向燒瓶中加入30 mL濃硝酸，超聲30 min，靜置，用吸管吸除上層混酸清液，然后加入1 000 mL水稀釋，稀釋液過0.22 μm的聚四氟乙烯微孔濾膜，水洗至濾液pH值為7.0，所得黑色固體經真空烘箱50 ℃干燥即得被氧化的改性MWNTs。

1.4 樣品處理

稱取粉碎的新會陳皮2.00 g于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈-水(80∶20，體積比，下同)，振蕩1 min，再加入0.6 g改性MWNTs，振蕩1 min，超聲10 min，5 000 r/min離心5 min，吸取上層清液過0.22 μm有機相濾膜，供上機測定。

2 結果與討論

2.1 MWNTs表面改性

MWNTs獨特的中空管結構以及高比表面積使之具有作為凈化吸附劑的優異性能。但未改性的MWNTs由于表面缺少活性官能基團，限制了其在吸附領域的應用，因此須對MWNTs表面進行氧化改性，使其表面產生一定量的羧基、羥基等活性官能基團。本研究中氧化改性前后的透射電鏡照片(TEM)見圖1。由圖1可見，氧化改性后所得MWNTs分散均勻，有一定的長徑比，長度分布均勻，說明本研究所采用的氧化改性方法效果好。氧化前后MWNTs的紅外光譜見圖2，可觀察到氧化后的MWNTs在3 414 cm-1處出現較寬的吸收峰，該吸收峰由羥基伸縮振動所引起，在1 704 cm-1處的吸收峰羧基中的羰基伸縮振動所引起，這些結果可以說明強酸氧化后MWNTs的表面產生了羥基和羧基官能基團。

圖1 未經氧化(A)及混酸氧化后(B)所得MWNTs的TEM照片

Fig.1 TEM images of MWNTs of raw untreated(A) and treated(B) with a mixture acid by oxidation

圖2 未經氧化(a)及混酸氧化后(b)所得紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of MWNTs of raw untreated(a) and treated(b) with a mixture acid by oxidation

2.2 提取溶液的選擇

將目標化合物從樣品中有效提取是多殘留分析必須解決的首要問題，樣品提取一般采用有機溶劑加水作為提取溶液，提取液含水可以濕潤基質，增強有機溶劑的滲透能力，便于有機溶劑的滲入和萃取，從而提高對目標化合物的提取效率。本研究的目標化合物為脂溶性物質，溶于乙腈、乙醚和氯仿等有機溶劑，但乙醚、氯仿等有機試劑毒性大，而乙腈能有效沉淀蛋白質和脂肪，適用性廣，因此真菌毒素、農藥檢測一般選擇乙腈-水作為提取溶液。本研究以2,4-D、滅多威、AFB1和ZEN作為考察物，以回收率作為考察指標，在新會陳皮空白樣品中添加25 μg/kg混標，考察了乙腈-水體積比分別為100∶0，90∶10，80∶20，70∶30時的回收率。結果顯示，當乙腈-水比例為80∶20時提取效果最好。因此，實驗選用乙腈-水(80∶20)作為提取溶液。

2.3 凈化吸附劑的選擇

新會陳皮基質復雜，為了消除雜質干擾，本研究對改性MWNTs，Florisil，PSA，硅膠4種吸附劑的凈化作用進行了比較。在空白新會陳皮中添加一定量的混合標準溶液，分別采用改性MWNTs，Florisil，PSA和硅膠吸附劑進行凈化，以2,4-D、滅多威、AFB1和ZEN的回收率作為考察指標。結果表明，Florisil能有效地吸附極性化合物，但凈化液呈淺黃色，PSA能有效去除提取液中的有機酸、脂肪酸、糖類，但去除生物堿、色素、維生素、黃酮化合物等的效果不佳，用Florisil和PSA作凈化吸附劑，雜質對目標化合物有干擾；硅膠對蛋白質、脂肪、維生素等雜質有較高的吸附量，但也能牢固吸附目標化合物，4種化合物的回收率低。改性MWNTs可有效除去樣品中的水溶性和脂溶性雜質，凈化液無色，雜質背景對目標化合物檢測無影響且回收率最高。此外，改性MWNTs能在廣泛的pH值范圍內保持穩定，保證了凈化效果及方法的通用性，因此本研究采用改性MWNTs作為凈化吸附劑。

考察了改性MWNTs吸附劑用量分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g時對目標化合物回收率的影響。結果顯示，隨著吸附劑用量增加，目標化合物的回收率增大，這是由于真菌毒素和農藥含π電子少，雜質與吸附劑能形成更強的π-π吸附而減少了對目標化合物的干擾。當吸附劑用量為0.6 g時回收率最高，繼續增加吸附劑用量，目標化合物的回收率無明顯變化，因此，選擇吸附劑的最佳用量為0.6 g。

2.4 質譜條件的優化

配制9 種真菌毒素、農藥混合標準溶液，用蠕動泵以10 μL/min的流速連續注射，在正離子模式下進行一級母離子全掃描，得到目標化合物的分子離子峰，優化去簇電壓、霧化氣、氣簾氣等參數。根據歐盟2002/657/EC《質譜分析方法鑒定點數》指令要求，在確定母離子的基礎上選擇兩個以上的子離子，打碎目標分子離子峰進行二級質譜掃描(子離子掃描)，采集全掃描的二級質譜圖，得到碎片離子信息，對碰撞能、碰撞室出口電壓等參數進行優化，最終每種目標化合物分別選擇1 個定量離子外標法定量，2 個定性離子和豐度比為定性依據，質譜參數見表1。

圖3 9 種化合物的基質效應Fig.3 Matrix effects of nine compounds

2.5 基質效應

基質效應指樣品中被分析物以外的組分對分析過程及結果準確性的影響和干擾。不同真菌毒素、農藥在同一基質中具有不同的基質效應，同一真菌毒素、農藥在不同基質中的基質效應也不同，同時基質效應還與濃度具有一定的關系，隨著濃度增加，基質效應逐漸減弱。本實驗對新會陳皮的基質效應進行了研究，樣品基質效應采用標準曲線測定法，即配制2 組標準曲線，第1 組、第2 組分別用純有機溶劑、基質空白提取液配制混合標準溶液，分別繪制有機溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線，采用基質匹配標準曲線斜率和有機溶劑標準曲線斜率之比(K)來評價基質效應：若K值介于0.9～1.1之間，基質效應不明顯，K大于1.1時為基質增強效應，小于0.9則是基質抑制效應。結果顯示：以新會陳皮作為基質時，AFG2，AFG1，AFB2和AFB1為基質減弱效應，2,4-D和ZEN表現為基質增強效應，其他3 種化合物無明顯的基質效應(見圖3)。為提高定量的準確性，本實驗采用基質匹配標準溶液(即以空白的新會陳皮凈化液配制標準溶液制作校正曲線)校正方法進行定量分析和計算，對基質效應進行補償。

2.6 線性范圍與檢出限

以空白新會陳皮基質提取液為溶液，根據9種化合物的響應強弱，配制不同質量濃度的混合標準溶液，在優化的色譜-質譜條件下進行測定，以定量離子的儀器響應峰面積(y)對各目標化合物的濃度(x)進行線性回歸，9 種目標化合物的線性范圍、相關系數和檢出限見表2。由表可見目標化合物在各自線性范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.983 8～0.998 2，以3 倍信噪比(S/N=3)計算方法檢出限(LOD)為0.18～10 μg/kg，混合標準溶液的總離子流圖見圖4。

圖4 混合標準溶液(A)、新會陳皮(B)與新會陳皮添加標準品(C)的總離子流圖

Fig.4 TIC chromatograms of mixed standard solution(A),a xinhui dried orange peel(B) and a xinhui dried orange peel spiked with standards(C) the peak numbers(1-9) denoted were as the same as those in Table 1

2.7 回收率與精密度

為了評價方法的適用性，在上述最優條件下，取新會陳皮空白樣品，按低、中、高3個濃度水平分別添加混合標準液，每個濃度水平重復6 次考察方法精密度，結果見表2。各目標化合物的加標回收率為72.4%～106%，相對標準偏差(RSD)為2.2%～7.4%。方法的準確度高、穩定性好，可滿足痕量分析的要求。

表2 方法的線性范圍、相關系數、檢出限、平均回收率及相對標準偏差(n=6)

(續表2)

No．CompoundLinearrange(μg/L)rLOD(μg/kg)Spiked(μg/kg)RecoveryR/%RSDsr/%3Chlorpyrifos1 0～1000 99822 55 0，10，5096 4，101，1025 8，6 3，2 24AFG20 10～200 99630 180 50，1 0，5 0101，96 3，1067 4，5 8，3 95AFG10 10～200 99410 240 50，1 0，5 072 4，91 2，92 63 9，6 6，4 56AFB20 10～200 99240 200 50，1 0，5 085 6，92 4，93 45 6，6 2，6 07AFB10 10～200 99120 210 50，1 0，5 092 7，88 3，89 56 2，7 1，5 68OTA5 0～5000 99631025，50，25083 8，89 7，96 16 2，6 2，5 89ZEN5 0～5000 99249 725，50，25092 4，99 5，1034 2，5 3，7 2

2.8 實際樣品的分析

采用本文建立的方法對300余份日常送檢的新會陳皮進行檢測，以實驗室空白、平行樣和樣品加標進行質量控制，其中6 份樣本檢出2,4-D(8.9～12 μg/kg)，3 份樣本檢出OTA(26.8～95.5 μg/kg)，其余樣品未檢出真菌毒素和農藥。

3 結 論

研究結果表明，以改性MWNTs作為凈化劑，將QuEChERS凈化法與HPLC-MS/MS結合可用于新會陳皮中真菌毒素和農藥殘留的檢測。方法的加標回收率為72.4%～106%，RSD為2.2%～7.4%，檢出限為0.18～10 μg/kg，方法前處理步驟簡便快速，結果準確，檢出限滿足國內外標準的限量要求。此外，該方法能同時完成真菌毒素和農藥殘留2 類不同組分的檢測，為食品安全提供了技術保障，具有一定的推廣價值。

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Determination of Nine Mycotoxins and Pesticide Residues in Xinhui Dried Orange Peel by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with QuEChERS Clean-up

PENG Xiao-jun1*,ZENG Li-zhu2,WU Chang-chun1,LIANG Wei-hua1

(1.Xinhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jiangmen 529100,China;2.Yangjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yangjiang 529500,China)

An analytical method based on QuEChERS with modified multiwalled carbon nanotubes(MWNTs) as adsorbent was developed.The determination of 6 mycotoxins and 3 pesticides residues,including 2,4-D,methomyl,chlorpyrifos,AFG2,AFG1,AFB2,AFB1,OTA and ZEN in xinhui dried orange peel was carried out by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).The factors affecting the extraction，purification and detection efficiency were optimized，and the optimal conditions were as the following：the samples were extracted with acetonitrile-water(80∶20) mixed solution，and purified by QuEChERS method with modified MWNTs as adsorbent.The separation was performed on a Shimadzu C18(150 mm×2.1 mm×3.5 μm) column,then determined by LC-MS/MS under multiple reaction monitoring(MRM) mode and quantified by external standard method with the matrix-matched standards solution.Under the optimized conditions,the calibration curves of 9 compounds were linear in the respective concentration ranges with correlation coefficients of 0.983 8-0.998 2.The detection limits(S/N=3) were in the range of 0.18-10 μg/kg.The recoveries at low,medium and high spiked levels ranged from 72.4% to 106%,with relative standard deviations of 2.2%-7.4%.With the advantages of accuracy,high sensitivity，easy operation and rapidness,the method was suitable for the simultaneous determination of mycotoxins and pesticide in xinhui dried orange peel,and was applied in the rapid screening of toxic and harmful substances in foods with satisfactory results.

QuEChERS；modified multiwalled carbon nanotubes；liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)；mycotoxins；pesticide residue；xinhui dried orange peel

2017-01-09；

2017-02-13

國家質檢總局科技項目(2016IK066 );江門市科技項目(20161408 )

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.006

O657.63；S852.44

A

1004-4957(2017)06-0738-06

*通訊作者：彭曉俊,碩士,高級工程師,研究方向:食品安全,Tel:0750-6312076,E-mail:pxj2129@163.com