魚肉樣品中的手性多氯聯苯對映體的分離測定研究

朱 帥，饒 竹

(國家地質實驗測試中心，北京 100037)

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魚肉樣品中的手性多氯聯苯對映體的分離測定研究

朱 帥*，饒 竹

(國家地質實驗測試中心，北京 100037)

該文建立了魚肉樣品中7種手性多氯聯苯(PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB132，PCB 136，PCB 149和PCB 174)對映體的分離測定方法。樣品經快速溶劑萃取技術萃取后，濃縮液經過凝膠滲透色譜除脂及大分子物質后再依次通過酸性硅膠柱、復合硅膠柱凈化和堿性氧化鋁柱分離得到PCBs 組分。在氣相色譜-質譜(GC-EI/MS)上對比研究了BateDex-325，CP-Chirasil，BGB-172SE，Chirasil-Dex和Cyclosil-B手性色譜柱的拆分效果，發現7種手性PCBs在Cyclosil-B毛細管柱上的分離效果最好，其分離度為0.8～2.3，可以實現基線分離。在優化色譜條件下，7種手性PCBs在10～200 μg·L-1濃度范圍內線性良好，相關系數為0.998～1.000，方法檢出限(S/N=3)為0.4～5.0 ng·g-1。在高、低2個加標水平下，7種手性PCBs的回收率為89.2%～114%，相對標準偏差為0.3%～2.1%，表明方法靈敏度高、回收率好、準確度高。采集廣東電子垃圾拆解污染區魚類樣品驗證方法的適用性，結果顯示魚肉樣品中均檢出7種手性PCBs，3種魚肉樣品中7種手性PCBs的總濃度為386.7～602.8 ng·g-1。對3種魚肉組織中7種手性PCBs 的EF值進行測定，發現PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB 132，PCB 136和PCB 174的EF 值與標準品具有顯著差異，表明這些手性PCBs 在魚類體內可能具有對映體選擇性富集和代謝作用，此外PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB 132和PCB 136在3種魚肉組織中的分布特征相似，而PCB174的EF值在烏鱧體內大于標準品，而在鯪魚、鯽魚體內卻小于標準品，表明PCB174在烏鱧和鯪魚、鯽魚體內的選擇性代謝過程可能相反。

手性；多氯聯苯；氣相色譜-質譜;魚肉；對映體分離

多氯聯苯(PCBs)作為典型的持久性有機污染物具有化學性質穩定、脂溶性強和易在生物體中富集[1]等特性。此外，PCBs具有致癌性，可對免疫、生殖和神經系統造成危害，并可通過生物放大作用對高等動物，尤其是人類健康帶來巨大的潛在風險[2]，從而引起世界各國的廣泛關注。由于氯原子取代位置的差異，209 種PCBs 同系物中有78 種因分子存在手性軸而具有手性，其中19 種可在室溫下穩定存在[3]。根據全世界公布的生產數據：手性PCBs的制造總量達29 500噸，占總PCBs總量的6%[4]。研究表明，普遍存在于動物、植物、昆蟲和微生物體內的細胞色素單加氧酶P-450(CYP450)參與PCBs各異構體的生物富集與代謝過程，并具有明顯的對映體選擇性，這與酶的獨特手性活性位點有關[5-6]。并且不同對映體與生物體內酶或受體表面的結合位點的親和力不同，導致手性化合物對生物體產生的毒性效應也表現為明顯的對映體選擇性[7]。因此，這些PCBs的對映體在生物蓄積、代謝、轉化以及毒性效應等多方面均呈現選擇性差異[7-8]。但一直以來，在研究手性 POPs環境行為及生態效應時，一般將其視為單一化合物[9]。而且，幾乎所有的環境法規也將其作為單一化合物管理，這可能會高估或者低估該類污染物的生態風險和健康安全效應[5]。

由于對映體具有相同的物理和化學性質(如疏水性、蒸氣壓、極性等)，因此對環境樣品中手性PCBs進行分離測定比較困難，測定過程中需采用專門的手性色譜柱進行分析。此外，環境樣品含有較多同系物和其他干擾物質，樣品中含有的PCBs單體之間會在分離過程中發生峰共溢現象，對手性化合物的準確測定極其不利。目前，對映體分離方法有氣相色譜法、高效液相色譜法和多維氣相色譜法等。Chen等[10]利用GC-EI/MS測定了中國南部土壤中的手性PCB 95，136，149，84，132和183，并基本實現了基線分離，該方法采用手性Chirasil-Dex色譜柱對PCB 95，136和149進行分離，BGB-172色譜柱對PCB 84，132和183進行分離。戴守輝等[11]利用Chirasil-Dex與BGB-172色譜柱對蓮藕及底泥中的6種PCBs對映體進行分離分析，取得了較好的分離效果，但使用兩根色譜柱分離PCBs無形中增加了分析時間和工作量。Virginia等[12]采用中心切割多維氣相色譜技術測定生物樣品中的手性PCBs，同時考察了3種β-環糊精色譜柱(Chirasil-Dex，BGB-172，BGB-176SE)的分離效果，發現BGB-176SE的分離效果最好，可實現6種手性PCBs的有效分離，但由于多維氣相色譜技術普及程度很低，成本較高，不適于常規檢測[13]。目前手性PCBs的分析方法還有待改善。近年來，盡管利用手性固定相制成的手性色譜柱拆分手性PCBs 對映體得到不斷發展，但不同手性柱仍然只能分離有限的手性單體。

我國是電子垃圾拆解的主要地區之一，近年來大量發達國家的電子廢棄物進入我國，這些電子垃圾在一些地區(主要是農村或者城市郊區)進行粗放式的拆解，成為我國環境中PCBs的重要來源，電子垃圾回收地成為我國PCBs污染最為嚴重的地區之一[14]。PCBs可在魚類的脂肪組織中富集，盡管已有關于電子垃圾拆解區魚類中檢測到PCBs的報道[15-16]，然而這些研究主要集中于外消旋體，手性PCBs 在魚類中的選擇性富集則少有報道。鯪魚、鯽魚和烏鱧是清遠城鎮居民經常食用的魚類，可以有效反映當地居民經食魚類而發生PCBs的暴露風險。本研究利用氣相色譜-質譜法對比研究了CP-Chirasil，BateDex-325，Cyclosil-B，Chirasil-Dex和BGB-172SE等商用手性色譜柱對7種典型手性PCBs的分離效果，以期實現7種手性PCBs單體的拆分，并采用本文所建立的方法對電子垃圾拆解區池塘中的鯪魚、鯽魚和烏鱧樣品中7種典型的手性PCBs進行了拆分測定，對手性單體的手性特征進行了探討。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

加速溶劑萃取儀(Dionex ASE 350，USA)，氮吹濃縮儀(Organomation Associates，USA)，旋轉蒸發儀(Heidolph，Germany)，層析柱(酸性硅膠柱，復合硅膠柱，堿性氧化鋁柱)。

手性PCBs 標準品(純度>97%，美國AccuStandard 公司)；二氯甲烷(農殘級)、正己烷(農殘級)、無水甲醇(分析純)、丙酮(農殘純)均購自美國Fisher公司；柱層析硅膠(試劑純，100～200 目，青島海洋化工廠)，堿性氧化鋁(100～200 目，上海五四化學試劑廠)；硝酸銀(分析純)、濃硫酸(優級純)、無水硫酸鈉(優級純)均購自北京北化精細化學品有限責任公司。

1.2 樣品的采集

抽樣地點位于清遠市龍塘鎮，廣州市以北約50 km。 據估計，該地區電子垃圾拆解的車間有1 300間，工人8萬名，每年拆解的電子垃圾達170萬噸。底棲性魚類樣品于2016年同時采集于廣東省清遠市龍塘鎮某電子垃圾拆卸場附近水塘。鯪魚(Cirrhinusmoliorella,n=7)、鯽魚(Carassiusauratus,n=7)和烏鱧(Ophicephalusargu,n=7)采完后冰浴運輸至實驗室放入-20 ℃冰柜保存，實驗前取出解凍，取魚肉(不包含魚皮)勻漿后，冷凍干燥。

1.3 儀器參數

手性PCBs 的分析采用Agilent 7890B-5975N 型氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司)， 使用Cyclosil-B(30 m× 0.25 mm × 0.25 μm)色譜柱進行拆分。選擇離子掃描模式(SIM)，不分流進樣，進樣量1 μL。載氣為高純氦氣，進樣口溫度為270 ℃，柱流速為1.0 mL·min-1。升溫程序:起始溫度100 ℃，保持1 min，10 ℃·min-1升溫至200 ℃，保持1 min，再以1 ℃·min-1升溫至220 ℃，并保持30 min。電離方式為電子轟擊(EI)，70 eV，質譜掃描范圍為50～450 amu，傳輸線溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃。

1.4 樣品提取與凈化

對魚樣品中目標物的提取采用加速溶劑萃取法(ASE350，Dionex，USA)。魚肉樣品解凍后，用萬能粉碎機粉碎攪勻。稱取約8.0 g 干燥后的樣品置于燒杯中，與質量比為1∶3的硅藻土充分混合，轉入底部墊有濾膜的提取筒中。提取溶劑為正己烷-二氯甲烷( 1∶1，體積比)，溫度為120 ℃，壓力為1 500 psi，靜態提取時間10 min，循環提取3 次。溶劑淋洗體積為70% 萃取池體積，氮氣吹掃時間為120 s。提取完的溶液用活化的銅片除硫。加速溶劑提取后的樣品濃縮液經過凝膠滲透色譜除脂及大分子物質后，依次通過酸性硅膠柱和復合硅膠柱凈化，利用堿性氧化鋁柱分離得到PCBs組分，將所得樣品濃縮后，轉入進樣瓶，封裝待測。

1.5 分離度(R)及對映體分數(EF)的計算

文獻中通常用分離度(R)表示色譜圖中目標化合物的分離效果，其計算公式為:R=1.18(tR2-tR1)/(W1/2(1)+W1/2(2))[12]，式中tR1和tR2為1對對映體的保留值，W1/2(1)和W1/2(2)為對應的半峰寬。

PCB 在環境樣品中的手性組成一般用對映體分數(EF)表示，其計算公式為:EF=A1/(A1+A2)[5，17]，當手性PCBs 在色譜柱上的出峰順序不確定時，A1表示手性化合物第1個出峰的對映體濃度，A2表示第2 個出峰的對映體濃度；當手性PCBs 的出峰順序確定時，A1表示(+)對映體濃度，A2表示(-)對映體濃度；當EF為0.5 時，表明手性單體為外消旋體。本研究中PCB 136，PCB149，PCB91和PCB95的出峰順序確定，其中PCB136 和PCB149為(-)對映體先出峰，PCB91和PCB95為(+)對映體先出峰[18-19]，其余PCBs對映體出峰順序未確定。

2 結果與討論

2.1 手性PCBs對映體的拆分

圖1 手性PCBs在Cyclosil-B毛細管柱上的拆分色譜圖Fig.1 Chromatogram of chiral PCBs separated by Cyclosil-B column

為了實現7種手性PCBs單體的同時分離測定，本研究選擇5種含不同固定相的手性柱，分別為BateDex-325(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，CP-Chirasil(25 m×0.25 mm×0.25 μm)，BGB-172SE(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，Chirasil-Dex(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和Cyclosil-B(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，在最優化色譜條件下對7種手性PCBs進行拆分。結果顯示，手性PCBs標準品在BateDex-325上的拆分效果最差，僅PCB-174可實現拆分，其分離度為0.7(見表1)；4種手性PCBs標準品(PCB 91，PCB132，PCB 136和PCB 149)在CP-Chirasil色譜柱上的分離效果較好，其分離度為0.9～1.6；BGB-172SE和Chirasil-Dex分別可以實現5種和6種手性PCBs的分離，其分離度分別為0.6～1.6和0.6～2.1；手性PCBs標準品PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB132，PCB 136，PCB 149和PCB 174可在Cyclosil-B手性毛細管柱上獲得良好的拆分效果，其分離度為0.8～2.3(見圖1)。結果表明，使用Cyclosil-B毛細管柱進行分離時，對手性PCBs 拆分的分離度較高。采用Cyclosil-B毛細管柱，對色譜條件進行優化，并對7種手性PCBs 單體的標準品進行全掃描,以確定每個目標物的保留時間及特征離子(見表2)。

表1 手性PCBs 在5根毛細管柱上的分離度(R)

表2 手性PCBs 的掃描離子及保留時間

*quantitation ion

2.2 方法確認

配制濃度梯度依次為10，20，50，100，200 μg·L-1的7種PCBs的標準溶液，按照“1.3”設置儀器參數，分別測定7種PCBs對映體，以峰面積(y)對其質量濃度(x,μg/L)進行線性回歸，得到峰面積～濃度校準曲線。14種目標化合物回歸方程的線性關系良好，相關系數為0.998～1.000。按照“1.3”的儀器參數和“1.4”樣品前處理方法，得到7 種PCBs 的方法檢出限(S/N=3)為0.4～5.0 ng·g-1。在經前處理后的空白魚肉樣品(提取凈化后濃縮液中手性PCBs的濃度低于檢出限)中加入10 μg·L-1和100 μg·L-1的混合標準溶液混合均勻，做基質加標實驗，每個基質加標空白魚肉樣平行測定7次，測得回收率為89.2%～114%，相對標準偏差(RSD)為0.3%～2.1%，表明本實驗所建立的方法對PCBs 的回收率較好，準確度較高。

2.3 生物樣品中PCBs 的手性特征測定

利用本方法在清遠市龍塘鎮某電子垃圾拆卸場附近水塘所采集的鯪魚、鯽魚和烏鱧魚肉組織內檢測到高含量的手性PCBs(表3)，7種手性PCBs的總濃度為386.7～602.8 ng·g-1，高于美國環保署(USEPA)規定的魚肉組織中PCBs 含量限值(20 ng·g-1)濕重的標準，表明魚類在該電子垃圾拆解區由于不規范的拆解活動已受到嚴重污染。鯪魚、鯽魚和烏鱧魚肉組織中具有相似的PCBs同族體組成，均以PCB 91，PCB 95，PCB 132，PCB 136 和PCB 149為主，占7種手性PCBs總量的90%以上。除PCB 149對映體在鯪魚、鯽魚和烏鱧魚3種魚肉組織中不存在顯著的濃度差異外，1-PCB 45，(-)PCB 91，(-)PCB 95，(-)PCB 132和(-)PCB 136在3種魚肉組織中均高于其相應的對映體，但1-PCB 174在烏鱧體內的濃度低于其相應的對映體2-PCB 174。

表3 魚肉樣品中7種手性PCBs的含量(n=7，濕重)

采用本方法對魚肉組織中7種手性PCBs 的EF值進行測定，結果顯示，PCB 45，PCB 91，PCB 95，PCB 132， PCB 136 和PCB 174的EF 值與標準品存在顯著差異，表明這些手性PCBs 在魚類體內可能具有對映體選擇性富集和代謝作用，PCB 149 的EF 值與標準品無明顯差異，以外消旋體存在于鯽魚和鯪魚體內。

從魚肉樣品中手性PCBs EFs值的箱線圖(圖2)可以看出，不同種類的魚肉樣品的EF值不同，說明它們對PCBs的富集能力不同，這可能與其生活習性和所處的營養級不同有關。鯪魚和鯽魚具有相似的營養級，烏鱧處在較高的營養級。鯪魚的食物以浮游植物為主，喜舐刮沉積物上的附著物，同時也攝取腐殖質和其他有機碎屑，是一種食草性魚類。鯽魚是以植物為食的雜食性魚類。烏鱧的食物主要以鯪魚、鯽魚等其他較小魚類為主，是一種肉食性魚類。烏鱧體內的手性PCBs的EFs值顯著低于鯪魚和鯽魚(PCB 174除外)，可能是由于烏鱧以鯪魚、鯽魚等其他魚類為食物，這些化合物通過食物鏈的生物放大效應導致了其較低的EFs值。PCB 174的EF值在烏鱧體內大于標準品，而在鯪魚、鯽魚體內卻小于標準品，這可能是因為烏鱧雖然通過捕食鯪魚、鯽魚等其他魚類，通過生物放大作用獲得了食物中的手性特征，但烏鱧自身可選擇性地富集代謝不同的對映體，通過自身選擇代謝而獲得的手性特征強于從食物中獲得的手性特征。

3 結 論

本文采用氣相色譜-質譜法對比研究了5種商用手性色譜柱對7種典型的手性PCBs的分離效果，結果表明，Cyclosil-B毛細管柱可同時實現標樣中7 種手性PCBs的拆分。方法具有較高的靈敏度、準確性和重現性，這對進一步研究手性PCBs 對映體的選擇性環境行為和生物毒性差異具有重要意義。應用本方法在電子垃圾拆解區魚肉樣品中可檢測到7種手性PCBs，表明該區域不規范的電子垃圾拆解活動已造成魚類乃至水體的污染，需引起相關部門的重視。通過對魚肉組織中7種手性PCBs 的EF值進行測定，表明在魚類的體內，手性PCBs具有對映體選擇性富集和代謝作用，本方法適用于多種魚肉樣品中痕量手性PCBs的拆分。

圖2 標準品及魚肉樣品中手性PCBs的EFs值

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Enantiomeric Separation of Chiral Polychlorinated Biphenyls in Fish Samples

ZHU Shuai*,RAO Zhu

(National Research Center for Geoanalysis,Beijing 100037,China)

A method was developed for the separation and determination of 7 chiral polychlorinated biphenyls(PCBs) congeners(PCB 45,PCB 91,PCB 95,PCB 132,PCB 136,PCB 149 and PCB 174) in fish samples.The target chemicals were extracted by accelerated solvent extraction，cleaned up by gel permeation chromatography,acidified with silica gel column and multi-layer silica gel column，and were further fractioned with alkaline alumina columns．The chiral PCBs were identified and quantified by gas chromatography-mass spectrometry with electron impact ion source(GC-EI/MS).Five commercially available chiral capillary gas chromatography columns(BateDex-325,CP-Chirasil,BGB-172SE,Chirasil-Dex and Cyclosil-B) were evaluated for their ability to separate enantiomers of 7 chiral PCBs.Among the columns studied,Cyclosil-B capillary column obtained the best results,providing the simultaneous separation of 7 chiral PCBs with the enantioselective resolution of 0.8-2.3.The calibration curves of these seven chiral PCBs showed good linearities in the range of 10-200 μg·L-1with correlation coefficients 0.998-1.000.The limits of detection(LOD,S/N=3) were all below 5.0 ng·g-1.The method was applied in the determination of the analytes in spiked fish samples,with recoveries of of 89.2%-114% and relative standard deviations(RSDs,n=7) of 0.3%- 2.1%，suggesting the high degree of accuracy and efficiency of the established method．The developed method was applied in fish samples which collected from a reservoir surrounded by several e-waste recycling workshops in Guangdong.PCBs and enantiomer franctions(EFs) of chiral PCBs(PCB 45,PCB 91,PCB 95,PCB132,PCB 136,PCB 149 and PCB 174) were analyzed in three kinds of fish samples.The concentrations of chiral PCBs ranged from 386.7 ng·g-1to 602.8 ng·g-1in fish smaples.The EF values of chiral PCBs(PCB 45,PCB 91,PCB 95,PCB 132,PCB 136 and PCB 174) were significantly different with those in standard solution,which meaned that these chiral PCBs had enantioselective enrichment and metabolism in fish tissue.In addition,the EF values of chiral PCBs of PCB 45,PCB 91,PCB 95,PCB 132 and PCB 136 in three kinds of fish tissue were similar,with an exception of PCB 174．The declined EFs of PCB 174 inCirrhinusmoliorellaand Cirrhinus moliorella were rebounded inOphicephalusargu.This result may suggest that theOphicephalusarguandCirrhinusmoliorellaorCarassiusauratuspreferred to biotransform different enantiomers of PCB congeners.

chiral;polychlorinated biphenyl;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);fish sample;enantiomer separation

2017-02-03；

2017-03-03

中國地質科學院基本科研業務費專項經費(CSJ201603)；國家自然科學基金(21607033)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.007

O657.63;TQ241.31

A

1004-4957(2017)06-0744-07

*通訊作者：朱 帥，碩士，研究方向：持久性有機污染物的分析方法與環境行為研究，Tel:010-68999590，E-mail:zhu15131215153@ 126.com