超高效液相色譜-串聯四極桿質譜法測定麻辣燙中喹諾酮類藥物殘留

趙 飛，高廣慧，賈宏新

(遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110015)

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超高效液相色譜-串聯四極桿質譜法測定麻辣燙中喹諾酮類藥物殘留

趙 飛*，高廣慧，賈宏新

(遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110015)

建立了麻辣燙中14種喹諾酮類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯四極桿質譜(UPLC-MS/MS)檢測方法。采用酸化乙腈提取麻辣燙中的喹諾酮類藥物殘留，提取溶液經鹽析和C18固相萃取柱凈化后，在電噴霧離子源中正離子模式下，采用多反應監測(MRM)方式進行測定，內標法定量。結果顯示，14種喹諾酮類藥物在7.5～100 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.990。在3個不同加標水平下的平均回收率為75.4%～110.0%，相對標準偏差(n=6)為1.3%～10.1%，14種化合物的檢出限和定量下限分別為0.5，1.5 μg/kg。該方法操作簡單、快速，凈化效果好，靈敏度高，適用于麻辣燙中多種喹諾酮類藥物殘留的同時定性和定量檢測。

固相萃取；超高效液相色譜-串聯四極桿質譜法；喹諾酮類藥物；麻辣燙

喹諾酮類藥物是一類合成抗菌藥物，其抗菌譜廣，見效快，成本低，被廣泛用于醫療[1-2]。同時該類藥物也是衛生部公布的“食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單”中禁用于麻辣燙食品中的藥物。當前對該類藥物檢測方法的研究中，較多的是對動物源性食品[3-9]和豆芽的檢測研究，對于麻辣燙中該類藥物的檢測尚未見報道。不法商販將喹諾酮類藥物添加在麻辣燙類食品中用于殺菌，防止人們食用變質的該類食物后出現腸胃不適等情況。但長期攝入這類藥物會影響人體正常的腸道菌群分布，并催生該類藥物的耐藥性。

目前，食品中喹諾酮類藥物的檢測方法主要有液相色譜法[3-4]、液相色譜-質譜聯用法[5-10]、酶聯免疫法[11]。由于不同種類的食品基質組分相差較大，檢測麻辣燙中喹諾酮類藥物時，不僅要求樣品前處理方法要具有普適性和高效性，而且要具有較高的選擇性。因此，本文以市售的麻辣燙為研究對象，對麻辣燙中喹諾酮類藥物檢測的樣品前處理條件、分離條件和質譜檢測條件進行了優化，建立了超高效液相色譜-串聯質譜檢測麻辣燙中喹諾酮類藥物的方法，并對市售200批次樣品進行了檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ESI TQD三重四極桿質譜儀，XEVO超高效液相色譜儀，BEH Shield RP18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，Oasis HLB固相萃取柱，均購于美國Waters公司；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；渦旋混合儀(德國IKA公司)；高速冷凍離心機(美國熱電公司)；氮吹儀(上海屹堯儀器科技發展有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(色譜純，上海安譜科學儀器有限公司)；氯化鈉、氨水(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液的配制

14種喹諾酮類標準品包括氟羅沙星(Dr.Ehrenstorfer，99.6%)、氧氟沙星(Dr.Ehrenstorfer，99.0%)、諾氟沙星(中國食品藥品檢定研究院，99.5%)、依諾沙星(中國食品藥品檢定研究院，91.1%)、環丙沙星(中國食品藥品檢定研究院，84.2%)、恩諾沙星(Dr.Ehrenstorfer，98.5%)、鹽酸洛美沙星(Dr.Ehrenstorfer，99.0%)、甲磺酸達氟沙星(Dr.Ehrenstorfer，94.0%)、奧比沙星(Dr.Ehrenstorfer，97.8%)、鹽酸雙氟沙星(Dr.Ehrenstorfer，98.0%)、鹽酸沙拉沙星(Dr.Ehrenstorfer，95.0%)、司帕沙星(中國食品藥品檢定研究院，99.8%)、氟甲喹(Dr.Ehrenstorfer，98.3%)、培氟沙星(中國食品藥品檢定研究院，71.1%)；3種內標物標準品氘代諾氟沙星、氘代環丙沙星和氘代恩諾沙星均購自Witega。

分別精密稱取各標準品、內標標準品適量，各加入0.2 mL甲酸，用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度約1 000 mg/L的單標準儲備液，置于棕色瓶中，于-18 ℃冰箱中保存。將上述儲備液用甲醇稀釋為0.5 mg/L的混合標準中間液，用于質譜參數優化。使用時根據需要，以0.1%甲酸-乙腈(95∶5)溶液逐級稀釋為混合標準工作液，現用現配。

2%甲酸乙腈溶液的配制：量取490 mL乙腈，向其中加入10 mL甲酸，混合均勻即得。

1.3 樣品處理

稱取勻質后的試樣5.00 g于50 mL離心管中，加入100 ng/mL混合內標溶液0.2 mL，加入10 mL 2%甲酸乙腈溶液，擰緊上蓋，于渦旋混合儀上渦旋30 s；以7 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至另一50 mL離心管中，殘留物再用10 mL 2%甲酸乙腈溶液提取2次，合并3次提取液；向提取液中加入3.0 g氯化鈉，擰緊上蓋，于渦旋混合儀上渦旋30 s，將上清液(乙腈層)轉移至另一50 mL離心管中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋30 s，棄去正己烷層，乙腈層于氮氣流下吹至近干，加入5 mL水，渦旋混合30 s，10 000 r/min離心10 min，待用。

依次用6 mL甲醇、6 mL水活化HLB小柱(200 mg，6 mL)，將樣品溶液轉移至小柱中，以6 mL 5%甲醇洗滌小柱，抽干后，用6 mL甲醇洗脫樣品，收集洗脫液于氮氣流下吹至近干，用1.00 mL初始比例流動相溶解，渦旋混合30 s，過0.22 μm濾膜供LC-MS/MS分析。

1.4 空白基質匹配混合標準溶液的配制

取空白基質麻辣燙樣品，按“1.3”方法處理樣品，濃縮至近干，加入混合標準工作溶液1.00 mL復溶，渦旋混合30 s，過0.22 μm濾膜，即得空白基質匹配混合標準溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱：BEH Shield RP18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈溶液；流速：0.4 mL/min。梯度洗脫程序：0 min，96%A；0～1 min,96%～90%A；1～3 min,90%～40%A；3～4 min,40%～96%A。

1.6 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；多反應監測(MRM)；噴霧電壓3 kV；離子源溫度：450 ℃；霧化氣流速：0.8 L/min；質譜采集參數見表1。

表1 喹諾酮類藥物的質譜參數

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 色譜條件 本研究選擇乙腈作為流動相有機相，分別考察了在水相中不加酸以及分別加0.1%乙酸、0.2%乙酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸后對色譜分離和質譜靈敏度的影響。結果表明，在水相中加酸后，各化合物的離子化效率明顯提高，峰形更好；在水相中各添加相同體積分數的甲酸和乙酸時，由于甲酸的酸性高于乙酸，添加甲酸的效果略優于乙酸，且在質譜流動相中甲酸的使用更為普遍；向水相中添加不同體積分數的甲酸時，各化合物的離子化效率無明顯變化。因此，選擇加入0.1%甲酸溶液即可滿足要求。

圖1 麻辣燙中14種喹諾酮類藥物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 14 kinds of quinolones standard

以0.1%甲酸溶液作為水相，分別以乙腈和0.1%甲酸乙腈溶液作為有機相，實驗結果表明，以0.1%甲酸-乙腈作為流動相時，14種喹諾酮類化合物響應較好；以0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈溶液作為流動相時，除氟甲喹的響應較前者有明顯增強之外，其余喹諾酮類藥物的響應均降低，因此最終選擇0.1%甲酸-乙腈為流動相。

采用選定的流動相，對混合標準溶液進行分離，優化梯度洗脫程序，使所有待測化合物均具有良好的峰形和靈敏度，優化后的梯度洗脫程序見“1.5”。由于各喹諾酮類化合物的性質相近，保留時間較為接近，本研究通過碎片離子的差異進行區分。圖1為4 μg/kg添加水平下，麻辣燙中目標化合物的總離子流色譜圖。

2.1.2 質譜條件 采用質譜直接進樣的方式將0.5 mg/L的混合標準中間液進樣，分別進行正離子和負離子全掃描分析，所有待測化合物的最佳準分子離子峰均在正離子掃描模式下獲得，母離子均為[M+H]+。以各化合物的準分子離子為母離子，通過改變錐孔電壓，選擇準分子離子響應最好的電壓作為錐孔電壓；對準分子離子進行二級全掃描，得到其碎片離子信息；通過改變碰撞能量，選擇穩定且響應最好的兩個碎片離子作為特征子離子，其中豐度相對較強的為定量離子，另一個作為定性離子，再對兩個碎片離子的碰撞能量進行優化，使定量離子和定性離子的響應最優。優化后得到的質譜參數見表2。

表2 麻辣燙空白樣品中14種喹諾酮類藥物的基質效應、回收率與精密度(n=6)

*quantitative ion

2.2 樣品前處理條件的優化

2.2.1 提取溶劑的選擇 麻辣燙樣品的種類繁多，成分復雜，所以樣品前處理過程中提取溶劑的選擇尤為重要。有機溶劑中乙腈和甲醇對喹諾酮類化合物具有較好的提取效果，同時兩種溶劑具有沉淀蛋白的作用；但由于甲醇極性大于乙腈，采用甲醇提取時，會提取出更多的極性雜質，增加了后續除雜難度，因此選擇乙腈為提取溶劑。麻辣燙中的喹諾酮類藥物應為人為添加，藥物在樣品中的存在形式以游離態為主，且該類化合物大多帶有伯胺或仲胺基團，具有一定的弱堿性，因此考察了添加不同體積分數甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑的提取效果，實驗表明，2%甲酸乙腈溶液作為提取溶劑時提取效率最優，因此最終選擇其為最佳提取溶劑。

2.2.2 凈化條件的優化 本研究采用2%甲酸乙腈溶液作為麻辣燙樣品中喹諾酮類藥物的提取液，因麻辣燙樣品本身含水量較大，且乙腈和水互溶，因此本文采用氯化鈉作為鹽析劑，以緩解提取中的乳化現象，并將大量的水溶性雜質除去，減少質譜污染。

麻辣燙樣品中含有的大量油脂會隨著2%甲酸乙腈溶液一并提取出來，為了減少最終檢測溶液中油脂的含量，需對提取液進行除油操作。考慮到常用除油試劑石油醚、乙醚較易揮發，所以選擇乙腈飽和的正己烷進行除油。

選用Waters Oasis HLB 固相萃取柱進行后續凈化，考察了淋洗液濃度和洗脫液體積，最終選擇6 mL 5%甲醇溶液作為淋洗液，6 mL甲醇作為洗脫液。

2.2.3 基質效應的評價 基質效應是存在于樣品前處理過程直至最終測試溶液中的干擾物在質譜中與目標化合物競爭電離，進而影響目標化合物的檢測靈敏度和重現性的現象。本研究中，分別配制了相同含量的基質工作曲線和溶劑標準曲線，進樣測試，得到兩條標準曲線，通過計算同一目標化合物兩條曲線的斜率比值，來評價各目標化合物基質效應的影響，結果見表2，其中奧比沙星呈現較為明顯的基質抑制效應，為了得到更準確的定量結果，本研究中采用基質工作曲線。

2.2.4 線性方程、檢出限與定量下限 按照“1.4”方法配制濃度為7.5，15，30，50，75，100 μg/L 6個濃度水平的混合基質工作溶液，并在優化的色譜-質譜條件下進行檢測。以目標化合物定量離子的峰面積與內標物定量離子峰面積的比值(y)作為縱坐標、質量濃度(x，μg/L)為橫坐標繪制曲線。結果顯示，14種喹諾酮類藥物在7.5～100 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r)為0.990 1～0.999 3。實驗采用空白樣品中添加混合目標組分的方法，按照前處理過程和儀器條件進行樣品前處理和檢測，以定量離子色譜峰信噪比(S/N)大于3作為檢出限，S/N>10作為定量下限，確定麻辣燙中14種喹諾酮類藥物的檢出限均為0.5 μg/kg，定量下限均為1.5 μg/kg。

2.2.5 回收率與精密度 在空白麻辣燙樣品中添加14種喹諾酮類藥物的混合標準溶液，制備含量分別為1.5，3.0，15 μg/kg的加標樣品，按照“1.3”處理方法及“1.5”和“1.6”的測定條件進行回收率實驗，每個加標水平平行6份，結果見表2。各化合物的平均回收率為75.4%～110.0%，相對標準偏差為1.3%～10.1%。

圖2 陽性樣品的代表譜圖Fig.2 Representative chromatograms of positive sampleA：chromatogram of ciprofloxacin's quantitative ion;B:chromatogram of deuterated ciprofloxacin's quantitative ion

2.3 實際樣品的檢測

采用本文建立的方法，對185批麻辣燙和15批麻辣燙底料食品進行檢測，樣品采自沈陽、大連、本溪、撫順、鐵嶺、盤錦、鞍山、阜新、遼陽、營口各地，覆蓋了以上各城市的麻辣燙店、燒烤店、飯店、小吃街和批發市場等，結果在麻辣燙底料中未檢出本文的14種喹諾酮類化合物，有8批次麻辣燙中檢出喹諾酮類藥物，其中檢出恩諾沙星為3.3 μg/kg，諾氟沙星2.6 μg/kg，環丙沙星分別為2.4,6.3,137,3.5,3.0,166,6.8 μg/kg。陽性樣品的代表譜圖見圖2。

3 結 論

本研究采用酸化乙腈提取麻辣燙樣品中的喹諾酮類化合物，結合固相萃取凈化方法，建立了UPLC-MS/MS同時檢測麻辣燙及底料中14種喹諾酮類藥物的分析方法。該方法操作簡便、快速、準確，其靈敏度、回收率和精密度均符合檢測技術的要求，可為食品檢驗檢測機構進行麻辣燙及其底料中的喹諾酮類藥物檢測提供技術支持。

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Determination of Quinolones in Hotpot Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Fei*,GAO Guang-hui,JIA Hong-xin

(Liaoning Institute for Food Control,Shenyang 110015,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was established for the determination of 14 quinolones in hotpot.Samples were extracted with acidified acetonitrile,defated withn-hexane,separated on a C18solid phase extraction(SPE) column,and analyzed by LC-ESI-MS/MS under the positive mode with multiple reaction monitoring(MRM).The method showed good linearities for 14 quinolones over the range of 7.5-100 μg/L with correlation coefficients(r) more than 0.990.The detection limits of 14 quinolones were 0.5 μg/kg,and the quantitation limits were 1.5 μg/kg.The recoveries of all analytes in hotpot ranged from 75.4% to 110.0%with relative standard deviations(RSD,n=6)of 1.3%-10.1%.The method has the advantages of simplicity,rapidness,good purifying effect and sensitivity,and is suitable for the simultaneous determination of quinolones in hotpot.

SPE;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);quinolones;hotpot

2017-01-22；

2017-02-15

國家質檢總局科研計劃項目(2016IK169)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.011

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)06-0768-05

*通訊作者：趙 飛，碩士，工程師，研究方向：理化分析，Tel：13940021647，E-mail：60340837@qq.com